王一飛 安永鑄 王 韜 李 磊 鄭亞男 李 萍 任曉東

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，張家口075000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的胃腸道惡性腫瘤，是全球范圍內(nèi)癌癥死亡的第二大原因［1］。奧沙利鉑是CRC手術(shù)切除后最常用的化療藥物之一，可顯著改善患者（尤其是晚期CRC）無(wú)病生存期和總體生存期的生活質(zhì)量［2］。然而，天然或獲得性?shī)W沙利鉑耐藥性仍然是CRC 治療的主要挑戰(zhàn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸、缺乏蛋白質(zhì)編碼能力的RNA 轉(zhuǎn)錄本，其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因組印跡和染色質(zhì)修飾參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥等生物學(xué)過(guò)程，是CRC進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［3-4］。長(zhǎng)基因間非編碼RNA 01116（LINC01116）是一種新型的 lncRNA，其通過(guò)參與細(xì)胞生長(zhǎng)、周期停滯、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和耐藥在多種人類癌癥中發(fā)揮致癌作用［5-7］。然而，LINC01116在CRC進(jìn)展和奧沙利鉑耐藥中的潛在作用并不清楚。序列分析發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p 與LINC-01116 可能存在相互作用。miR-9-5p 已被證實(shí)在CRC 中起抑癌作用［8］，但 miR-9-5p 是否參與 CRC 奧沙利鉑耐藥仍然未知。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-8 細(xì)胞、奧沙利鉑耐藥細(xì)胞（HCT-8/L-OHP）中LINC01116、miR-9-5p表達(dá)水平，探討其參與HCT-8/L-OHP 耐藥的分子機(jī)制，以期為克服臨床CRC 奧沙利鉑耐藥提供有效靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 收集 2016 年 5 月至 2018 年 5 月我院經(jīng)手術(shù)切除的43 例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距離腫瘤邊緣大于5 cm 的正常組織），患者男31 例，女12 例。年齡48~76 歲，中位年齡55 歲。術(shù)后30 min 內(nèi)采集組織標(biāo)本，迅速置于液氮中保存。本研究開展前已獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有入選者或其家屬均知情同意。

1.1.2 主要試劑 人CRC 細(xì)胞HCT-8、HCT-8/LOHP 購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；Trizol 試劑、放射免疫沉淀測(cè)定（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購(gòu)自廣州吉賽生物科技有限公司；PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix 購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；miR-9-5p模擬物（miR-9-5p mimics）、miR-9-5p抑制物（anti-miR-9-5p）、小干擾RNA（si-LINC01116）、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-LINC01116）及所有陰性對(duì)照（miR-NC、anti-miR-NC、si-NC、pcDNA）由廣州復(fù)能基因公司提供；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購(gòu)自上海艾博抗生物技術(shù)公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin-V-FITC/PI）試劑盒購(gòu)自上海凱基生物公司；兔源細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）、p21、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和 Bcl 相關(guān) X 蛋白（Bax）單克隆抗體以及山羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT-8/L-OHP、HCT-8 細(xì)胞均采用補(bǔ)充10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。為維持對(duì)奧沙利鉑耐藥性，培養(yǎng) HCT-8/L-OHP 細(xì)胞時(shí)加入 5 μmo/l L 奧沙利鉑。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)LINC01116和miR-9-5p表達(dá) Trizol試劑用于提取HCT-8細(xì)胞、各組HCT-8/L-OHP細(xì)胞的總RNA。使用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所得RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書配制20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。引物序列如下：LINC01116上游5′-CTTCTTTCCCTCCAAGTGAT-3′，LINC01116下游5′-TTAGCAAGTCAGCAAGTCCT-3′；GAPDH上游5′-CTCGCCTAGAGTGAGCTCC-3′，GAPDH下游5′-AACTGCTGCGTTGACGGGTATG-3'；miR-9-5p上游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游5′-GCGCTCTTTGGTTATCTAGC-3′；U6上游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。2-ΔΔCt公式計(jì)算LINC01116和miR-9-5p相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將對(duì)數(shù)期HCT-8/L-OHP細(xì)胞接種6孔板，利用LipofectamineTM2000將si-NC、si-LINC01116、miR-NC、miR-9-5p mimics、si-LINC01116+anti-miR-NC、si-LINC01116+anti-miR-9-5p分別轉(zhuǎn)染約50%融合的HCT-8/L-OHP細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，并含5 μmo/lL奧沙利鉑的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h，依次記為L(zhǎng)-OHP+si-NC組、L-OHP+si-LINC01116 組、L-OHP+miR-NC 組、LOHP+miR-9-5p組、L-OHP+si-LINC01116+anti-miR-NC組和L-OHP+si-LINC01116+anti-miR-9-5p組。

1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)期HCT-8、HCT-8/L-OHP 細(xì)胞接種 96 孔板，分別用含 2.5、5、10、20、40、80 μmo/l L 濃 度 奧 沙 利 鉑 處 理 細(xì) 胞48 h［9］，將 10 μl 的 CCK-8 溶液添加到 96 孔板各孔中，再孵育2 h 后，酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的光密度（OD）值，計(jì)算增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。將轉(zhuǎn)染后的HCT-8/L-OHP 細(xì)胞接種96 孔板，用含5 μmo/l L 奧沙利鉑的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h。按照CCK-8 使用說(shuō)明檢測(cè)OD450nm值，計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率（%）=［（OD對(duì)照孔-OD實(shí)驗(yàn)孔）/（OD對(duì)照孔-OD空白孔）］×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收獲各組HCT-8/L-OHP 細(xì)胞，結(jié)合緩沖液調(diào)整為1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。參照Annexin-V-FITC 和PI 凋亡試劑盒進(jìn)行染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將含有miR-9-5p結(jié)合位點(diǎn)的LINC01116 野生（WT）序列或突變（MUT）序列分別插入到pGL3 載體構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體。利用LipofectamineTM2000 試劑將WT-LINC01116、MUT-LINC01116與miR-9-5p mimics或miR-NC 分別共轉(zhuǎn)染HCT-8/L-OHP 細(xì)胞，熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)檢測(cè)共轉(zhuǎn)染48 h后熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot檢測(cè)CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) RIPA 法裂解HCT-8/L-OHP 細(xì)胞，BCA法進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏弗乙烯（PVDF）膜上。封閉膜后，用一抗溶液（均為1∶500 稀釋）4℃封閉膜過(guò)夜，隨后用二抗溶液（1∶500 稀釋）室溫孵育膜1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影后，Quantity One軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH 灰度值比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每組設(shè)置3 個(gè)平行試驗(yàn)，重復(fù)3 次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC01116 在 CRC 組 織中 的 表達(dá) CRC 組 織中LINC01116 表達(dá)量較癌旁組織顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 LINC01116在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)（，n=43）Tab.1 Expression of LINC01116 in colorectal cancer tis?sue（，n=43）

表1 LINC01116在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)（，n=43）Tab.1 Expression of LINC01116 in colorectal cancer tis?sue（，n=43）

Note：Compared with Adjacent tissues group，1）P＜0.05.

LINC01116 1.00±0.06 4.21±0.291）71.079 0.000 Groups Adjacent tissues Colorectal cancer tissues t P

2.2 奧沙利鉑對(duì)HCT-8細(xì)胞和HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率的影響 與HCT-8 細(xì)胞比較，奧沙利鉑對(duì)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞的增殖抑制率顯著降低（P＜0.05）。且HCT-8/L-OHP 細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值顯著高于HCT-8細(xì)胞（P＜0.05）。見表2。

表2 奧沙利鉑對(duì)HCT-8/ L-OHP及其親本細(xì)胞HCT-8增殖抑制率的影響（，n=9，μmol/ L）Tab.2 Effect of oxaliplatin on proliferation inhibition rate of HCT-8/ L-OHP and its parent cell HCT-8（，n=9，μmol/ L）

表2 奧沙利鉑對(duì)HCT-8/ L-OHP及其親本細(xì)胞HCT-8增殖抑制率的影響（，n=9，μmol/ L）Tab.2 Effect of oxaliplatin on proliferation inhibition rate of HCT-8/ L-OHP and its parent cell HCT-8（，n=9，μmol/ L）

Note：Compared with HCT-8 group，1）P＜0.05.

Oxaliplatin concentration Groups 5 IC50 7.90±0.77 66.13±8.931）19.490 0.000 HCT-8 HCT-8/ L-OHP t P 2.5 14.93±1.38 2.18±0.24 27.307 0.000 41.38±3.66 7.43±0.591）27.473 0.000 10 60.04±4.15 15.25±1.451）30.566 0.000 20 73.25±4.56 24.19±2.281）28.869 0.000 40 84.57±4.99 32.66±2.791）27.240 0.000 80 93.31±5.04 58.22±4.591）15.443 0.000

2.3 LINC01116 和 miR-9-5p 在 HCT-8 和 HCT-8/LOHP 中的表達(dá) 與HCT-8 細(xì)胞比較，HCT-8/L-OHP細(xì)胞中LINC01116 表達(dá)水平顯著升高，miR-9-5p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 LINC01116 和 miR-9-5p 在 HCT-8 和 HCT-8/ L-OHP中的表達(dá)（，n=9）Tab.3 Expression of LINC01116 and miR-9-5p in HCT-8 and HCT-8/ L-OHP（，n=9）

表3 LINC01116 和 miR-9-5p 在 HCT-8 和 HCT-8/ L-OHP中的表達(dá)（，n=9）Tab.3 Expression of LINC01116 and miR-9-5p in HCT-8 and HCT-8/ L-OHP（，n=9）

Note：Compared with HCT-8 group，1）P＜0.05.

miR-9-5p 1.00±0.06 0.48±0.041）21.633 0.000 Groups HCT-8 HCT-8/ L-OHP t P LINC01116 1.00±0.07 2.61±0.211）21.820 0.000

2.4 抑制LINC01116表達(dá)聯(lián)合奧沙利鉑（5 μmol/L）對(duì)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與LOHP+si-NC組比較，L-OHP+si-LINC01116組HCT-8/L-OHP細(xì)胞LINC01116表達(dá)顯著降低，增殖抑制率、凋亡率、p21 和 Bax 蛋白表達(dá)顯著升高，CyclinD1 和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見表4和圖1。

圖1 抑制LINC01116 表達(dá)聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8/ LOHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.1 Effect of LINC01116 inhibition combined with ox?aliplatin on proliferation and apoptosis of HCT-8/L-OHP cells

表4 抑制LINC01116表達(dá)聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9）Tab.4 Effect of LINC01116 inhibition combined with oxaliplatin on proliferation and apoptosis of HCT-8/L-OHP cells（，n=9）

表4 抑制LINC01116表達(dá)聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9）Tab.4 Effect of LINC01116 inhibition combined with oxaliplatin on proliferation and apoptosis of HCT-8/L-OHP cells（，n=9）

Note：Compared with L-OHP+si-NC group，1）P＜0.05.

Groups LINC01116CyclinD1 protein p21 protein Bcl-2 protein Bax protein 0.36±0.03 0.85±0.061）21.913 0.000 L-OHP+si-NC L-OHP+si-LINC01116 t P 1.00±0.07 0.55±0.041）16.745 0.000 Inhibition rate（%）7.23±0.60 57.68±4.881）30.783 0.000 Apoptosis rate（%）6.74±0.65 22.83±2.061）22.346 0.000 0.57±0.04 0.18±0.021）26.162 0.000 0.28±0.03 0.78±0.051）25.725 0.000 0.69±0.05 0.23±0.021）25.626 0.000

2.5 miR-9-5p 過(guò)表達(dá)聯(lián)合奧沙利鉑（5 μmol/L）對(duì)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與L-OHP+miR-NC 比較，L-OHP+miR-9-5p 組 HCT-8/L-OHP 細(xì)胞miR-9-5p 表達(dá)水平顯著升高，增殖抑制率、凋亡率、p21 和 Bax 蛋白表達(dá)顯著升高，CyclinD1 和 Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見表5和圖2。

表5 miR-9-5p過(guò)表達(dá)聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9）Tab.5 Effects of miR-9-5p overexpression combined with oxaliplatin on proliferation and apoptosis of HCT-8/L-OHP cells（，n=9）

表5 miR-9-5p過(guò)表達(dá)聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9）Tab.5 Effects of miR-9-5p overexpression combined with oxaliplatin on proliferation and apoptosis of HCT-8/L-OHP cells（，n=9）

Note：Compared with L-OHP+miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-9-5p CyclinD1 protein p21 protein Bcl-2 protein Bax protein 0.35±0.03 0.77±0.051）21.609 0.000 L-OHP+miR-NC L-OHP+miR-9-5p t P 1.00±0.08 2.97±0.231）24.269 0.000 Inhibition rate（%）7.36±0.74 47.74±3.131）37.665 0.000 Apoptosis rate（%）6.64±0.54 19.59±1.641）22.501 0.000 0.58±0.04 0.24±0.021）22.808 0.000 0.27±0.02 0.72±0.061）21.345 0.000 0.67±0.04 0.28±0.031）23.400 0.000

圖2 miR-9-5p 過(guò)表達(dá)聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-9-5p overexpression combined with oxaliplatin on proliferation and apoptosis of HCT-8/L-OHP cells

2.6 LINC01116 靶向調(diào)控 miR-9-5p 的表達(dá) Star-Base 在線預(yù)測(cè)顯示，LINC01116 與 miR-9-5p 之間存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。與miR-NC 和WT-LINC01116共轉(zhuǎn)染比較，miR-9-5p 和WT-LINC01116 共轉(zhuǎn)染可顯著降低HCT-8/L-OHP 細(xì)胞的熒光素酶活性（P＜0.05）；與 miR-NC 和 MUT-LINC01116 共轉(zhuǎn)染比較，miR-9-5p 和 MUT-LINC01116 共轉(zhuǎn)染對(duì) HCT-8/LOHP 細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)顯著影響，見表6。與pcDNA 組比較，pcDNA-LINC01116組HCT-8/L-OHP細(xì)胞miR-9-5p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與si-NC 組 比 較 ，si-LINC01116 組 HCT-8/L-OHP 細(xì) 胞miR-9-5p表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見表7。

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）Tab.6 Double luciferase report experiment（，n=9）

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）Tab.6 Double luciferase report experiment（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

MUT-LINC01116 1.02±0.06 1.01±0.07 0.325 0.749 Groups miR-NC miR-9-5p t P WT-LINC01116 1.00±0.06 0.51±0.041）20.385 0.000

表7 LINC01116調(diào)控miR-9-5p的表達(dá)（，n=9）Tab.7 LINC01116 regulates expression of miR-9-5p（，n=9）

表7 LINC01116調(diào)控miR-9-5p的表達(dá)（，n=9）Tab.7 LINC01116 regulates expression of miR-9-5p（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

miR-9-5p 1.00±0.04 0.41±0.041）1.01±0.07 2.59±0.212）602.592 0.000 Groups pcDNA pcDNA-LINC01116 si-NC si-LINC01116 F P

圖3 LINC01116 的序列中含有與miR-9-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.3 Sequence of LINC01116 contains a nucleotide se?quence complementary to miR-9-5p

2.7 抑制miR-9-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LINC01116 抑制聯(lián)合奧沙利鉑（5 μmol/L）對(duì)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞增殖和凋亡的作用 與L-OHP+si-LINC01116+anti-miRNC 組比較，L-OHP+si-LINC01116+anti-miR-9-5p 組HCT-8/L-OHP細(xì)胞miR-9-5p表達(dá)水平顯著降低，增殖抑制率、凋亡率、p21 和Bax 蛋白表達(dá)顯著降低，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見表8和圖4。

圖4 抑制miR-9-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LINC01116 抑制聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8/ L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的作用Fig.4 miR-9-5p inhibition reversed effect of LINC01116 inhibition combined with oxaliplatin on prolifera?tion and apoptosis of HCT-8/ L-OHP cells

表8 抑制miR-9-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LINC01116抑制聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8/ L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的作用（，n=9）Tab.8 miR-9-5p inhibition reversed effect of LINC01116 inhibition combined with oxaliplatin on proliferation and apopto?sis of HCT-8/ L-OHP cells（，n=9）

表8 抑制miR-9-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LINC01116抑制聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8/ L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的作用（，n=9）Tab.8 miR-9-5p inhibition reversed effect of LINC01116 inhibition combined with oxaliplatin on proliferation and apopto?sis of HCT-8/ L-OHP cells（，n=9）

Note：Compared with L-OHP+si-LINC01116+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-9-5p p21 protein Bcl-2 protein Bax protein 0.86±0.05 0.44±0.031）21.609 0.000 L-OHP+si-LINC01116+anti-miR-NC L-OHP+si-LINC01116+anti-miR-9-5p t P 1.00±0.06 0.54±0.031）20.572 0.000 Inhibition rate（%）59.35±4.45 21.48±1.681）23.885 0.000 Apoptosis rate（%）23.59±2.47 11.71±1.081）13.221 0.000 CyclinD1 protein 0.16±0.02 0.46±0.041）20.125 0.000 0.79±0.06 0.35±0.031）19.677 0.000 0.22±0.02 0.58±0.041）24.150 0.000

3 討論

LINC01116 已被證在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。SU 和 ZHANG 等［10-11］研究發(fā)現(xiàn)胃癌和骨肉瘤組織中LINC01116 表達(dá)升高，并作為致癌基因促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在乳腺癌組織中HU等［12］也觀察到 LINC01116 水平升高，這與患者的總體生存期、腫瘤大小和腫瘤轉(zhuǎn)移分期有關(guān)。此外，WANG 等［7］研究證實(shí) LINC00460 通過(guò)吸附 miR-769-5p 上調(diào)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中LINC00460表達(dá)量顯著升高，奧沙利鉑對(duì)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞的 IC50顯著高于 HCT-8 細(xì)胞，且 HCT-8/L-OHP 細(xì)胞中LINC00460 表達(dá)水平顯著高于HCT-8細(xì)胞，提示LINC00460 高表達(dá)可能與HCT-8 細(xì)胞奧沙利鉑耐藥有關(guān)。進(jìn)一步功能分析表明，轉(zhuǎn)染si-LINC00460 下調(diào)LINC00460 表達(dá)可顯著提高奧沙利鉑對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞的凋亡率和增殖抑制率。檢測(cè)增殖、凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，抑制LINC01116表達(dá)可降低促增殖蛋白CyclinD1 和抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平，升高抗增殖蛋白p21 和促凋亡蛋白Bax 表達(dá)水平，與功能分析結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，抑制LINC01116 表達(dá)可降低HCT-8/L-OHP 細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而降低HCT-8/L-OHP細(xì)胞奧沙利鉑耐藥性。

由于lncRNA 是非編碼RNA，它只能通過(guò)調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能。研究顯示lncRNA 與miRNAs 相互作用是其參與基因表達(dá)的重要途徑［13］。例如，LINC01116 通過(guò)吸附 miR-31 上調(diào)根蛋白表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［14］。lncRNA KCNQ1 重疊轉(zhuǎn)錄物 1（KCNQ1OT1）通過(guò)靶向miR-7-5p/藥耐藥相關(guān)蛋白1（ABCC1）途徑參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌奧沙利鉑耐藥［15］。本研究發(fā)現(xiàn)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞中 miR-9-5p 表達(dá)降低，且 LINC01116 對(duì)miR-9-5p 具有靶向負(fù)調(diào)控作用。既往研究證實(shí)，miR-9-5p 低表達(dá)與CRC 患者不良預(yù)后有關(guān)，是CRC潛在預(yù)后標(biāo)志物［16］。miR-9-5p 通過(guò)靶向谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶1（GOT1）抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和谷氨酰胺代謝［17］。此外，過(guò)表達(dá)miR-9-5p 還可降低間變性甲狀腺癌細(xì)胞的順鉑耐藥性［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimics 過(guò)表達(dá)miR-9-5p 可促進(jìn)奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、CyclinD1 和 Bcl-2 蛋白表達(dá)，促進(jìn) p21 和 Bax 蛋白表達(dá)，表明miR-9-5p 可降低HCT-8/L-OHP 細(xì)胞的奧沙利鉑耐藥性。進(jìn)一步研究顯示，抑制miR-9-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LINC01116 抑制對(duì)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞奧沙利鉑耐藥性的影響。這些結(jié)果表明，LINC01116 至少部分通過(guò)調(diào)節(jié)miR-9-5p 表達(dá)促進(jìn)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞奧沙利鉑耐藥。

綜上所述，LINC01116 在CRC 奧沙利鉑耐藥中發(fā)揮促進(jìn)作用。抑制LINC01116表達(dá)可提高奧沙利鉑對(duì)HCT-8/L-OHP 細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，進(jìn)而降低歲奧沙利鉑的耐藥性，其機(jī)制與調(diào)控miR-9-5p 表達(dá)有關(guān)。因此，LINC01116 有望成為克服CRC奧沙利鉑耐藥的有效靶點(diǎn)。