史向輝 嚴(yán)婷婷 沈 潔 葉 俏

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床常見(jiàn)的自身免疫性疾病，多發(fā)于中老年人群，主要臨床表現(xiàn)為慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥[1]。目前臨床上以藥物治療和手術(shù)治療為主，可一定程度緩解炎癥反應(yīng)和改善關(guān)節(jié)功能，但RA 病情反復(fù)，治愈難度較大，早診斷、早治療可有效提高治療效果、緩解疼痛、提高生活質(zhì)量[2-3]。T、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞的水平、功能異常在RA 的病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cells，Breg）通過(guò)產(chǎn)生白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子而負(fù)性調(diào)節(jié)免疫功能，同時(shí)還能抑制Th細(xì)胞（Th1、Th17）的分化、增殖，從而進(jìn)一步降低樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）釋放炎性因子[4-5]。DC 是機(jī)體功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，參與免疫應(yīng)答的起始環(huán)節(jié)，可直接激活靜息型T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中髓系樹(shù)突狀細(xì)胞（mDC）參與滑膜炎癥的發(fā)生[6]。RA患者外周血中Breg、mDC和Th細(xì)胞作為維持機(jī)體免疫功能的重要免疫細(xì)胞，均參與RA 的發(fā)生過(guò)程，但關(guān)于其水平變化與疾病程度的相互關(guān)系文獻(xiàn)報(bào)道并不多見(jiàn)，因此本文將通過(guò)實(shí)例進(jìn)一步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江省嘉興市第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科于2017 年8 月—2019 年12 月收治的96例RA患者為研究組，根據(jù)28 處關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度積分（disease activity score in 28 joints，DAS28）[7]評(píng)分：低度活動(dòng)24例、中度活動(dòng)40例、高度活動(dòng)32例；病情程度[8]：Ⅰ級(jí)20例、Ⅱ級(jí)24例、Ⅲ級(jí)30例、Ⅳ級(jí)22例；同時(shí)選取同期我院體檢健康者60 名為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，批件號(hào)：No.jxey-2018044。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) RA患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《2010 中國(guó)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診療及治療指南》[9]的RA分類標(biāo)準(zhǔn)；（2）患者病歷資料完整，依從性好，具備讀寫(xiě)能力，均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴隨其他風(fēng)濕性疾病（干燥綜合癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膝骨關(guān)節(jié)炎等），甲狀旁腺功能亢進(jìn)或減退癥等；（2）嚴(yán)重的心腦血管疾病、皮膚疾病、胃腸疾病等，其他慢性疾?。ㄈ缣悄虿。?；（3）入組前3 個(gè)月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素、雌激素或者補(bǔ)充鈣劑；（4）骨質(zhì)疏松、感染、骨折、腫瘤等引起的關(guān)節(jié)疼痛或者損傷；（5）哺乳期、妊娠期婦女。

1.3 方法 外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平：采用流式細(xì)胞儀（廠家：賽默飛世爾，型號(hào)：Attune NxT）檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD11c+CD123-mDC、CD19+CD24hiCD38hi Breg 以及Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞水平。所有患者入組后，空腹抽取外周靜脈血約5mL，肝素抗凝。淋巴細(xì)胞分離液Ficoll 密度梯度離心法進(jìn)行分離，吸取分層液的液面細(xì)胞提取外周血單核細(xì)胞（PBMC），磷酸鹽緩沖液重懸待測(cè)。檢測(cè)Breg 時(shí)分別加入anti CD19 APC 抗體（Invitrogen公司，批號(hào)SZB13444），檢測(cè)Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞時(shí)加入PE-Cy5-CD4 mAb（Invitrogen 公司，批號(hào)555348），室溫避光孵育15min 后加入固定膜劑/破膜劑混合液，4℃避光孵育60min。最后分別加入Anti-IL-10-PE、PE-cy7 標(biāo)記的抗人CD123 抗體、FITCIFNγ-mAb 抗體、FITC-IL-17 mAb（Becton Dickinson公司，批號(hào)MAB6607），于4℃溫孵育30min，用PBS洗滌3 次后并懸浮，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。檢測(cè)mDC時(shí)則加入FITC-CD4、APC-CD3、PE-CD24、APCCD38 抗體（Becton Dickinson 公司，批號(hào)3401111），室溫避光孵育15min 后加入固定膜劑/破膜劑混合液，室溫避光孵育15min，300r/min 離心約5min，棄上清液，加入染色緩沖液后重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)即可。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件分析所有數(shù)據(jù)，其中計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組和對(duì)照組一般資料比較 研究組和對(duì)照組性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。見(jiàn)表1。

表1 研究組和對(duì)照組一般資料比較

2.2 研究組和對(duì)照組外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平比較 研究組Breg 水平顯著低于對(duì)照組，而mDC、Th1、Th17 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 研究組和對(duì)照組外周血外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平比較（%，）

表2 研究組和對(duì)照組外周血外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平比較（%，）

注：研究組為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者；對(duì)照組為健康體檢者；Breg 為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；mDC 為樹(shù)突狀細(xì)胞；Th1 為輔助性T細(xì)胞1；Th17 為輔助性T細(xì)胞17

2.3 不同關(guān)節(jié)活動(dòng)度患者外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平比較 三組患者外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平差異顯著，其中低度活動(dòng)組患者Breg 水平顯著高于中度、高度活動(dòng)組患者，而mDC、Th1、Th17水平顯著低于中度、高度活動(dòng)組患者（P＜0.05），中度活動(dòng)組Breg 水平顯著高于高度活動(dòng)組患者，而mDC、Th1、Th17 水平顯著低于高度活動(dòng)組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同關(guān)節(jié)活動(dòng)度類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平比較（%，）

表3 不同關(guān)節(jié)活動(dòng)度類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平比較（%，）

注：Breg 為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；mDC 為樹(shù)突狀細(xì)胞；Th1 為輔助性T細(xì)胞1；Th17 為輔助性T細(xì)胞17；與低度活動(dòng)組比較，aP＜0.05；與中度活動(dòng)組比較，bP＜0.05

2.4 不同嚴(yán)重程度患者外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平比較 四組患者外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平差異顯著，其中Ⅰ級(jí)患者Breg 水平顯著高于Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)，而mDC、Th1、Th17 水平顯著低于Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)（P＜0.05）。Ⅱ級(jí)患者Breg 水平顯著高于Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)，而mDC、Th1、Th17 水平顯著低于Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)（P＜0.05）。Ⅲ級(jí)患者Breg 水平顯著高于Ⅳ級(jí)，而mDC、Th1、Th17 水平顯著低于Ⅳ級(jí)（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 不同嚴(yán)重程度類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平比較（%，）

表4 不同嚴(yán)重程度類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平比較（%，）

注：Breg 為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；mDC 為樹(shù)突狀細(xì)胞；Th1 為輔助性T細(xì)胞1；Th17 為輔助性T細(xì)胞17；與Ⅰ級(jí)比較，aP＜0.05；與Ⅱ級(jí)比較，bP＜0.05；與Ⅲ級(jí)比較，cP＜0.05

2.5 外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平與DAS28 評(píng)分的相關(guān)性 Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Breg 與DAS28 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.721，P＜0.05），與mDC、Th1、Th17 與DAS28 評(píng)分呈現(xiàn)正相關(guān)性（r=0.570、0.724、0.797，P＜0.05）。見(jiàn)圖1-4。

圖1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Breg 水平與DAS28 評(píng)分相關(guān)性（96例）

3 討論

圖2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血mDC 水平與DAS28 評(píng)分相關(guān)性（96例）

圖3 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Th1 水平與DAS28 評(píng)分相關(guān)性（96例）

RA患者體內(nèi)T、B細(xì)胞異常活化，導(dǎo)致大量的炎性因子（TNF-α、IL-1 等）、自身抗體（RF、CCP 抗體）產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)，引起血脂代謝紊亂、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失[10-11]。mDC 具有極強(qiáng)的激活T細(xì)胞反應(yīng)的能力，通過(guò)抗原提呈作用促進(jìn)T細(xì)胞活化以及分化為各種功能性亞群，Th1、Th17 是重要的炎癥細(xì)胞[12]。Th17 可大量分泌TNF-α、IL-17、Th1 可大量分泌IFN-γ、TNF-α 等，從而激活機(jī)體發(fā)生病理免疫應(yīng)答，如關(guān)節(jié)局部炎癥細(xì)胞的大量浸潤(rùn)及炎癥因子的大量釋放可導(dǎo)致炎癥損傷[13]。Breg 則可通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子而抑制巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，從而抑制關(guān)節(jié)炎癥[14]，因此免疫細(xì)胞水平的失衡對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，研究組Breg 水平顯著低于對(duì)照組，而mDC、Th1、Th17 顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明RA患者外周血mDC、Th1、Th17細(xì)胞水平明顯升高，而B(niǎo)reg 水平明顯降低，免疫狀態(tài)失衡，正調(diào)節(jié)相關(guān)的炎癥細(xì)胞大量產(chǎn)生，導(dǎo)致炎因子大量分泌，進(jìn)而引起骨侵蝕、關(guān)節(jié)破壞、滑膜損傷，導(dǎo)致RA 的發(fā)生。吳桂英和李鴻斌[14]研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血Breg細(xì)胞以及相關(guān)因子（TGF-β、IL-10）表達(dá)水平明顯低于健康人，通過(guò)有效治療后均存在增加趨勢(shì)，表明Breg細(xì)胞比例降低以及負(fù)性調(diào)節(jié)功能缺失是導(dǎo)致RA 的重要因素。IL-17 是Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，參與白細(xì)胞的遷移和活化，以及在骨質(zhì)破壞反應(yīng)中影響破骨細(xì)胞的活化以及骨質(zhì)的吸收，姚血明等[15]研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血Th17細(xì)胞水平明顯高于健康者，其水平與腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)以及DAS28 評(píng)分存在正相關(guān)性，與本次研究而結(jié)果相近。羅莉等[12]認(rèn)為，成熟的mDC 在外周血中的水平低于關(guān)節(jié)液，可能為成熟的mDC 遷移至關(guān)節(jié)液后并大量聚集，分泌大量的IL-12 誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞大量增殖等，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，引起關(guān)節(jié)疼痛，增加疾病活動(dòng)度。

圖4 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Th17 水平與DAS28 評(píng)分相關(guān)性（96例）

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，患者外周血mDC、Th1、Th17細(xì)胞水平均明顯增加，而B(niǎo)reg水平明顯降低，且通過(guò)Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示Breg 與DAS28 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.721，P＜0.001），mDC、Th1、Th17 與DAS28 評(píng)分呈現(xiàn)正相關(guān)性（r=-0.570、0.724、0.797，P＜0.001），表明Breg、mDC、Th1、Th17 與疾病嚴(yán)重程度密切關(guān)聯(lián)，可通過(guò)血清水平預(yù)測(cè)、評(píng)估疾病情況，從而指導(dǎo)醫(yī)師臨床診治。Th細(xì)胞與DC細(xì)胞間的相互調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，RA患者體內(nèi)存在著以Th1 為主體的多種免疫失衡狀態(tài)，其中mDC 是刺激、調(diào)節(jié)T細(xì)胞的最主要的DC細(xì)胞，如Ainola 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞（pDC）可誘導(dǎo)免疫耐受，通過(guò)抑制T細(xì)胞的應(yīng)答而降低IL-17 水平，表明機(jī)體免疫細(xì)胞相互調(diào)控，共同維持免疫狀態(tài)。韓捷等[17]認(rèn)為，mDC 激活后產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-α 等可促進(jìn)Th0 轉(zhuǎn)化為T(mén)h1，Th1 表現(xiàn)出免疫殺傷效應(yīng)，RA患者外周血中Th1 水平明顯高于健康者，且RA 病程中以Th1 免疫反應(yīng)為主，隨著疾病的進(jìn)展，外周血、關(guān)節(jié)液中Th1細(xì)胞水平展顯著升高，與本次研究結(jié)果相近。Breg細(xì)胞可降低CD4+T細(xì)胞的增殖，還能通過(guò)細(xì)胞間接觸以及分泌TGFβ 以增加Foxp3＋Treg細(xì)胞的表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)Foxp3＋Treg 可抑制RA患者的炎癥反應(yīng)[14]。Kim 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血中IL-10和Breg細(xì)胞水平明顯低于健康者，且Breg細(xì)胞表達(dá)率與DAS28 評(píng)分存在負(fù)相關(guān)性，與本次研究結(jié)果相近，進(jìn)一步表明Breg 在RA 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，從而改善炎癥反應(yīng)、自身抗體水平以及疾病活動(dòng)度。

綜上所述，RA患者外周血Breg、mDC和Th細(xì)胞水平均異常表達(dá)，其中Breg細(xì)胞水平與活動(dòng)度嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)，mDC和Th細(xì)胞水平與活動(dòng)度嚴(yán)重程度正相關(guān)。