柳小春 葉芳敏 呂偉旗

中藥龍脷葉系大戟科守宮木屬植物龍脷葉Sauropus spatulifolius Beille 的干燥葉，性平，味甘、淡，歸肺、胃經(jīng)，具有潤肺止咳、通便等功效，主要用于肺燥咳嗽、咽痛失音、便秘等癥，主要分布于廣西、廣東、福建、江蘇等省[1]。研究表明，龍脷葉含多種化合物，包括皂苷、糖類、生物堿、鞣質(zhì)、黃酮類、香豆素等[2]，具有止咳、祛痰、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、保肝、抗過敏等藥理活性[3]。目前，龍脷葉現(xiàn)有研究多集中于單體化合物提取分離、藥理活性、顯微與薄層鑒定與組學(xué)研究等，對于多產(chǎn)地含量測定比較研究鮮有報道[4-7]。山奈酚-3-O-龍膽二糖苷為2020 年版《中國藥典》規(guī)定的質(zhì)量評價指標(biāo)性成分，具有抗炎抑菌等活性[8]。藥用植物的活性成分受產(chǎn)地、經(jīng)緯度、海拔等生境影響，表現(xiàn)出較大的差異性，這種原藥材活性成分含量上的差異，嚴(yán)重影響中藥的臨床用藥與療效。本課題擬收集廣西、廣東、福建、江蘇等7 省18 個產(chǎn)地龍脷葉新鮮種質(zhì)資源，建立HPLC 法對其山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量進行快速測定，并分析其與生長性狀、經(jīng)緯度、海拔等因素間的相關(guān)性，以期為龍脷葉資源開發(fā)利用與優(yōu)良品種選育提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥材樣品 2020 年9 月—2020 年10 月，采集廣東、江蘇、上海、廣西、云南、海南、福建7 省18 個產(chǎn)地龍脷葉新鮮葉片，經(jīng)浙江省麗水市人民醫(yī)院藥學(xué)部葉芳敏副主任藥師鑒定為大戟科守宮木屬植物龍脷葉Sauropus spatulifolius 的葉片，見表1。

表1 龍脷葉樣品信息

1.2 儀器與試劑 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；DHG-9053A 臺式鼓風(fēng)干燥箱（無錫瑪瑞特科技有限公司）；ST 型-單槽超聲波清洗機（廣東固特超聲儀器有限公司）；FA1004 電子分析天平（上海光學(xué)儀器廠）；R-1002LN 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；山奈酚-3-O-龍膽二糖苷C27H30O16（B50372）購于上海源葉生物科技有限公司，甲醇、乙腈等試劑購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 生長性狀測定 取龍脷葉新鮮植株，用卷尺測量株高，用游標(biāo)卡尺測量枝條粗、葉長、葉寬，計算葉長寬比=葉長/葉寬，n=20。

2.2 山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量測定

2.2.1 系統(tǒng)條件 Agilent Extend-C18 色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動相乙腈—0.4%磷酸水溶液，體積流速1.0mL/min，檢測波長λ=349nm，進樣量10μL，柱溫30℃，HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 色譜圖（A 為標(biāo)品圖；B 為樣品圖；1 號峰為山奈酚-3-O-龍膽二糖苷）

2.2.2 線性關(guān)系 精密稱取山奈酚-3-O-龍膽二糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成濃度為62.20μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，移液管精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0mL，甲醇定容至10mL 容量瓶，搖勻取適量過0.22μm 濾膜，按照“2.2.1”系統(tǒng)條件下進樣，記錄峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)C，峰面積為縱坐標(biāo)Y 繪制線性方程，得山奈酚-3-O-龍膽二糖苷線性方程為Y=17359C＋3491.2，線性范圍為0.622～12.44μg/mL。

2.2.3 供試品含量測定 將烘干至恒重的龍脷葉粉碎，過60 目篩，精密稱取粉末0.5g，加入55%甲醇25mL，25℃條件下超聲提取（功率250W，頻率33kHz）40min，抽濾，取續(xù)濾液定容至50mL 容量瓶，即得供試品溶液。取適量，按照“2.2.1”系統(tǒng)條件下進樣，記錄峰面積，試驗平行三次（n=3）。

2.2.4 穩(wěn)定性分析 取江蘇玄武樣品，按照“2.2.3”方法下制備樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h 時按照“2.2.1”系統(tǒng)條件下進樣，得山奈酚-3-O-龍膽二糖苷峰面積RSD 為1.29%，樣品溶液24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性分析 取江蘇玄武樣品6 份，按照“2.2.3”方法制備樣品溶液，按照“2.2.1”系統(tǒng)條件進樣，記錄峰面積，得樣品山奈酚-3-O-龍膽二糖苷平均含量為0.056%，RSD 為2.83%，方法重復(fù)性良好。

2.2.6 精密度分析 取山奈酚-3-O-龍膽二糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“2.2.1”系統(tǒng)條件下連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，測得山奈酚-3-O-龍膽二糖苷峰面積RSD 為0.98%，儀器精密度良好。

2.2.7 加樣回收率分析 精密稱取已知含量的廣東羅湖樣品適量，分高、中、低三組，預(yù)設(shè)稱樣量分別為0.6、0.5、0.4g，加入山奈酚-3-O-龍膽二糖苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，按照“2.2.3”方法下制備樣品溶液，按照“2.2.1”系統(tǒng)條件下進樣，記錄峰面積，計算加樣回收率=（測得量－原有量）/加入量×100%。見表2。

表2 加樣回收率分析

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 生長性狀與山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量比較采用SPSS 軟件單因素方差A(yù)NOVA分析，聚類分析采取歐式距離，組間聯(lián)接法[9]。

3 結(jié)果

3.1 生長性狀分析 18 個產(chǎn)地龍脷葉生長性狀存在差異（P＜0.05 或P＜0.01）。株高、枝條粗變幅分別為12.89～38.23cm、2.17～4.64mm，其中海南龍脷葉植株較為高大，海南儋州樣品株高、枝條粗?jǐn)?shù)值最大，分別達(dá)38.23cm 與4.64mm，海南萬寧樣品葉片最大，平均葉長與葉寬分別為15.81cm 與6.23cm；江蘇龍脷葉植株相對較矮，其中江蘇玄武樣品株高與枝條粗分別為12.89cm 與2.17cm；葉型指數(shù)方面，廣東羅湖龍脷葉葉片最為狹長，葉長寬比為2.67，江蘇玄武葉片最為寬鈍，葉長寬比為1.73，見表3。

3.2 山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量分析 供試龍脷葉樣品中山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量存在差異（P＜0.01），平均含量0.061%，變幅0.036%～0.090%；云南樣品含量較高，其次為上海、廣西、福建、江蘇樣品，廣東、海南樣品含量較低，其中云南勐海樣品含量最高，達(dá)0.090%，是其他樣品的1.06～2.50 倍；18個產(chǎn)地龍脷葉山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量均滿足2020 年版《中國藥典》規(guī)定的不低于0.035%的標(biāo)準(zhǔn)（見表3），從山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量看，我國主分布區(qū)龍脷葉藥材質(zhì)量良好。

表3 18 個產(chǎn)地龍脷葉生長性狀與山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量比較

3.3 相關(guān)性分析 18 個產(chǎn)地龍脷葉山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量與生長性狀、生境因子關(guān)系密切，與經(jīng)度、株高、枝條粗、葉長、葉寬、葉長寬比呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與緯度、海拔呈正相關(guān)關(guān)系，其中與葉長呈最大負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.7991，與海拔呈最大正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.6469（見表4）；相關(guān)性分析顯示，從18個產(chǎn)地經(jīng)緯度與海拔范圍看，低經(jīng)度、高緯度、高海拔地區(qū)種植龍脷葉，有利于其葉片中山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量積累。

表4 18 個產(chǎn)地龍脷葉山奈酚-3-O-龍膽二糖苷與生長性狀、生境因子相關(guān)性分析

3.4 聚類分析 根據(jù)山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量與生長性狀，按照歐氏距離D2=12.00 劃分，可將18個產(chǎn)地分為3 大組，其中第1 組共4 個產(chǎn)地，分別為福建南靖、福建南安、江蘇宜興與江蘇玄武，該組龍脷葉植株較矮，枝條細(xì)，葉片小而多寬鈍，山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量中等大小；第2 組共7 個產(chǎn)地，包括云南屏邊、云南勐海、廣西青秀、廣西鐘山、廣西興寧、上海崇明與上海松江，該組龍脷葉植株矮，枝條細(xì)，葉片多小、寬鈍，山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量較高；第3 組共7 個產(chǎn)地，包括海南儋州，海南萬寧，廣東羅湖，廣東江門，廣東鼎湖，廣東順德，廣東天河，該組龍脷葉植株較高，枝條粗壯，葉片大而多狹長，山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量較低。見圖2。

圖2 基于歐式距離的18 個產(chǎn)地龍脷葉聚類分析圖

4 討論

龍脷葉在我國分布較廣，南北跨度大。山奈酚-3-O-龍膽二糖苷是2020 年版《中國藥典》規(guī)定的龍脷葉主要質(zhì)量評價指標(biāo)之一，具有抗炎、抑菌等活性[8]。本試驗在收集全國主分布區(qū)龍脷葉種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，參考《中國藥典》與已有龍脷葉含量測定文獻(xiàn)[1，10-11]，優(yōu)化了提取溶劑、超聲時間及流動相，建立的HPLC 方法洗脫山奈酚-3-O-龍膽二糖苷理論塔板數(shù)大于3500，符合2020 年版《中國藥典》規(guī)定的理論塔板數(shù)不低于3000 的要求[1]?？茖W(xué)的中藥質(zhì)量評價體系是保障中藥國際化、產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，通過中藥有效性—物質(zhì)基礎(chǔ)—質(zhì)量控制關(guān)聯(lián)鏈辨識質(zhì)量標(biāo)志成分，確定中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Quality marker，Qmarker）可以快速有效地對中藥材進行質(zhì)量評價[12]。山奈酚-3-O-龍膽二糖苷可作為龍脷葉藥材的Qmarker，本文建立的HPLC 用于測定該Q-marker 操作步驟簡便，方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可較為快速地評價龍脷葉藥材質(zhì)量。

供試龍脷葉樣品中山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量存在差異（P＜0.01），18 份樣品中，云南樣品含量較高，其中云南勐海樣品含量最高，達(dá)0.090%，其次為上海、廣西、福建、江蘇樣品，廣東、海南樣品含量較低；生境因子（經(jīng)緯度、海拔）、生長性狀與山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量積累關(guān)系密切，從18 個產(chǎn)地經(jīng)緯度與海拔范圍看，低經(jīng)度、高緯度、高海拔地區(qū)種植龍脷葉，有利于其葉片中山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量積累；以山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量為質(zhì)量評價指標(biāo)，高含量的龍脷葉藥材應(yīng)優(yōu)先在低經(jīng)度、高緯度、高海拔的云南產(chǎn)地中選擇；從生長性狀看，矮株、細(xì)枝、葉片寬鈍的龍脷葉中，山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量相對較高，為后續(xù)龍脷葉優(yōu)良品種選育提供參考依據(jù)。本試驗將在高山奈酚-3-O-龍膽二糖苷含量的龍脷葉優(yōu)良種質(zhì)篩選的基礎(chǔ)上，開展優(yōu)良種質(zhì)在區(qū)域（不同海拔）大田試驗，以期選育出品質(zhì)好，植株矮壯，葉片產(chǎn)量高的龍脷葉優(yōu)良品系。此外，有學(xué)者報道龍脷葉中富含咖啡酸[13]、生物堿[14]、β-谷甾醇[15]等活性物質(zhì)，在后續(xù)的質(zhì)量評價體系建立中，應(yīng)綜合考慮上述化學(xué)成分。