任懷新，王冬梅，王 慧，張澤洲，劉若莎，黃 薇，謝正豐

（北京林業(yè)大學水土保持學院，北京 100083）

0 引 言

世界上有100多個國家和地區(qū)存在鹽堿化問題，約有9.55×108hm2的土地具有鹽堿化趨勢[1]。土壤鹽化與堿化是兩種不同的非生物脅迫，中國的鹽堿地大多為鹽化與堿化同時存在的混合鹽堿地，比單一鹽脅迫、堿脅迫具有更大的危害性[2]。紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是世界上廣泛種植的一種豆科牧草，產量高、營養(yǎng)價值豐富，其根系粗壯，根系上的根瘤具有固氮的能力，在土壤改良中具有廣泛的應用[3]。禾本科植物黑麥草（Lolium perenneL.）是一種優(yōu)良的具有觀賞價值和使用價值的草坪草和牧草草種，其根系淺而密集，可有效改善土壤結構，常被用作生態(tài)修復植物[4]。近年來紫花苜蓿和黑麥草因其良好的經濟和生態(tài)效益在鹽堿地區(qū)得到廣泛的種植，但土壤鹽堿化嚴重威脅土地利用率，影響作物的生長發(fā)育[5-6]，降低作物的質量和產量[7]，甚至會導致作物死亡[8-9]，因此，如何改良鹽堿地、提高作物產量已成為當前農業(yè)發(fā)展所面臨的主要問題。

生物炭是農林廢棄物在缺氧或無氧條件下經熱裂解制成的穩(wěn)定、高度芳香化的固體富碳產物[10-11]，研究發(fā)現，生物炭具有較大的比表面積及豐富的孔隙結構，可促進土壤團聚體形成[12-14]，減緩鹽分脅迫[15-16]，改善土壤養(yǎng)分和結構狀況[17-18]。生物炭可有效改善植物幼苗地下根系和地上莖葉形態(tài)，提高作物光合及養(yǎng)分吸收能力[19-20]，減輕鹽堿脅迫所造成的非生物氧化脅迫[21]，提高作物產量[22]。目前有關生物炭對土壤性質以及植物生長生理的影響等方面研究較為廣泛，而關于生物炭對混合鹽堿脅迫下黑麥草和紫花苜蓿光合及抗氧化系統影響的研究有待深入。植物在逆境下會產生相應的應對機制，脅迫后第14 d是植物適應鹽堿環(huán)境的關鍵時期，隨著時間延長，植物會逐漸適應逆境[23]，有關黑麥草及紫花苜蓿在鹽堿脅迫下通過長期試驗，對不同生長期的生長狀態(tài)及作物產量影響的研究較多，均表明添加生物炭可促進植物生長[13-14]，但關于植物在鹽堿脅迫初期的響應機制研究較少，且缺少不同生物炭施用量影響的定量分析[24]。因此，本文采用盆栽試驗的方法，設置3種生物炭添加量，以黑麥草和紫花苜蓿為供試植物，探究不同生物炭用量對鹽堿脅迫初期黑麥草和紫花苜蓿生長指標、光合特性、丙二醛含量及抗氧化酶活性的影響，提出適宜的生物炭添加量，以期為鹽堿環(huán)境中科學應用生物炭，促進作物生長和增產提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所需土壤采自北京市昌平區(qū)農田（115°50′17″E，40°2′18″N），剝除表層植被后，取0～20 cm土層，帶回實驗室風干，過2 mm篩備用。試驗土壤PH值為7.85，容重為1.1 g/cm3，有機質含量為20.15 mg/g，全氮含量為0.81 mg/g，全磷含量為0.53 mg/g。試驗所用生物炭為500 ℃高溫裂解的玉米秸稈生物炭。供試植物為多年生豆科植物紫花苜蓿及禾本科植物黑麥草，試驗種子由北京正道生態(tài)科技有限公司提供。

1.2 試驗設計

試驗于2020年8－10月在北京林業(yè)大學苗圃進行。采用直徑13 cm、深度10 cm的塑料花盆進行盆栽試驗。試驗共設置正常土壤（CK），鹽堿脅迫處理（C0），鹽堿脅迫+1%生物炭（C1），鹽堿脅迫+3%生物炭（C2），鹽堿脅迫+5%生物炭（C3）5個處理，每個處理設置3個重復。試驗開始前，按比例稱量土壤和生物炭，其中，C1為1 000 g土壤+10 g生物炭，C2為1 000 g土壤+30 g生物炭，C3為1000 g土壤+50 g生物炭，CK和C0分別添加1 000 g土壤，將生物炭和土壤充分混合后裝入盆中。試驗前40 d為預處理期，每盆播種紫花苜蓿、黑麥草種子20粒，播種后進行常規(guī)培育，試驗開始前毎盆選取長勢相近的10株植物進行定苗。本試驗采用150 mmol/L的NaCl、Na2CO3、NaHCO3混合鹽堿溶液進行鹽堿脅迫，試驗開始后，C0、C1、C2、C3處理一次性添加100 mL混合鹽堿溶液，CK處理添加100 mL去離子水，試驗共進行14 d。試驗結束后，每盆選取5株植物測定葉片凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率及葉綠素含量；對10株植物進行破壞性取樣，清洗并吸干水分后，測定植物生物量、株高及根長；取頂部倒數第二片葉進行植物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性及過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性測定。

1.3 測定指標與方法

利用直尺法測量黑麥草和紫花苜蓿株高和根長，稱重法測定生物量，采用SPAD-502葉綠素速測儀測定植物葉綠素含量，采用LI－6400型便攜式光合儀（美國LI－COR公司）測定植物凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度及蒸騰速率；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量，采用試劑盒測定植物超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性，試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.4 數據處理與分析

使用Excel 2016對數據進行統計整理。采用SPSS 24.0對數據進行多重比較（Multiple Comparisons: Least Significant Difference），單因素方差分析（One way ANOVA）和Spearman相關性分析，使用Origin 8.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 生物炭對鹽堿脅迫下植物生長指標的影響

于試驗第14天進行植物生長指標測定。由圖1可知，鹽堿脅迫顯著降低黑麥草和紫花苜蓿的生物量（以10株計，下同），與CK相比分別降低了13.83%、26.53%，紫花苜蓿株高較CK顯著降低25.54%，鹽堿脅迫對黑麥草的株高、黑麥草和紫花苜蓿葉綠素含量及根長均無顯著影響（P＞0.05）。施加生物炭后，植物生長水平顯著提升，紫花苜蓿生物量和根長隨生物炭添加量增加先增大后減小，C2處理的生物量和根長顯著高于鹽堿處理，高出比例分別為48.50%、48.09%（P＜0.05）；生物炭處理的黑麥草生物量較鹽堿處理顯著提升34.00%～82.34%，C2處理黑麥草生物量達到最高，為21.31 g；C2處理的黑麥草根長較鹽堿處理高出17.15%，但與鹽堿處理無顯著差異（P＞0.05）。施加生物炭后鹽堿脅迫下黑麥草的株高顯著提高，且隨生物炭添加量的增加先增大后減小，其中C2處理株高達36.70 cm，較鹽堿處理顯著高出31.19%；C2處理的紫花苜蓿株高較鹽堿處理顯著高出44.16%，其他處理無顯著影響（P＞0.05），說明生物炭的緩解作用具有一定的閾值，施加量并非越大越好。施加生物炭顯著提高黑麥草的葉綠素含量，C1、C2、C3處理的黑麥草葉綠素含量較鹽堿處理顯著高出5.82%、12.16%、32.46%；C1、C2、C3處理的紫花苜蓿葉綠素含量較鹽堿處理分別提高0.12%、7.97%、6.64%，但與鹽堿處理無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 生物炭對鹽堿脅迫下植物光合特性的影響

于試驗第14天進行植物光合指標測定。由圖2可知，鹽堿處理顯著抑制黑麥草和紫花苜蓿的光合作用，與CK相比凈光合速率分別降低54.00%、38.04%，氣孔導度降低38.65%、80.27%，蒸騰速率降低35.90%、82.70%，胞間CO2濃度降低19.98%、25.02%。生物炭處理后，鹽堿脅迫對黑麥草和紫花苜蓿光合作用的抑制得到有效緩解，黑麥草葉片凈光合速率顯著提高，且隨生物炭添加量增加呈逐漸增大的趨勢，與鹽堿脅迫相比分別提升38.70%、85.00%和116.54%；紫花苜蓿葉片凈光合速率隨生物炭添加量增加呈先增大后減小的趨勢，C2處理的凈光合速率最高，較鹽堿處理顯著高出519.09%（P＜0.05）。生物炭對黑麥草和紫花苜蓿葉片氣孔導度和蒸騰速率產生了積極的影響，隨生物炭添加量增加均呈先增大后減小的趨勢，C2的施用效果最優(yōu)，氣孔導度較鹽堿處理分別提高118.69%、358.99%，蒸騰速率分別提高98.66%、526.53%（P＜0.05）。生物炭處理顯著提高黑麥草葉片胞間CO2濃度，且C1處理顯著高于C2、C3處理；紫花苜蓿葉片胞間CO2濃度隨生物炭添加量增大而增大，其中C2和C3處理顯著高于鹽堿處理（P＜0.05）。

2.3 生物炭對鹽堿脅迫下植物丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響

于試驗第14天進行植物丙二醛含量和抗氧化酶活性測定。由圖3可知，黑麥草和紫花苜蓿對鹽堿脅迫的抑制作用產生了積極的響應，與CK相比黑麥草和紫花苜蓿的MDA含量分別顯著提高21.23%、6.07%，CAT活性顯著提高10.50%、10.82%，SOD活性顯著提高11.80%、12.93%，POD活性顯著提高84.42%、20.09%（P＜0.05）。施加生物炭后，黑麥草和紫花苜蓿的滲透脅迫得到有效的緩解，MDA含量較鹽堿處理顯著降低，隨生物炭添加量增大黑麥草MDA含量逐漸降低，而紫花苜蓿MDA含量呈先降低后增加的趨勢（P＜0.05）。從圖3可以看出，生物炭處理促進黑麥草和紫花苜?？寡趸赶到y對鹽堿脅迫的響應，黑麥草CAT活性較鹽堿脅迫顯著提高9.66%～13.20%，各生物炭添加量處理無顯著差異；C1處理的紫花苜蓿CAT活性顯著高于鹽堿處理，隨著施炭量的增加，CAT活性逐漸降低。生物炭處理對鹽堿脅迫下黑麥草SOD活性無顯著影響；C1、C2、C3處理的紫花苜蓿SOD活性較鹽堿處理提升29.13%～31.86%，且不同生物炭添加量處理間顯著差異（P＜0.05）。C2、C3處理顯著降低鹽堿脅迫下黑麥草和紫花苜蓿的POD活性，C1處理無顯著影響（P＞0.05）。

2.4 生物炭處理鹽堿脅迫下植物生長生理指標相關性

生物量、株高以及根長之間存在極顯著正相關關系（P＜0.01），且均與葉綠素存在極顯著負相關關系（P＜0.01）。生物量、株高、根長與凈光合速率和氣孔導度存在顯著正相關關系（P＜0.01），與胞間CO2濃度無顯著相關性（P＞0.05），生物量與蒸騰速率存在極顯著正相關關系（P＜0.01），株高與蒸騰速率存在顯著正相關關系（P＜0.05），根長與蒸騰速率無顯著相關性（P＞0.05），葉綠素與凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率以及胞間CO2濃度均無顯著相關性（P＞0.05）。生物量與SOD活性存在顯著負相關關系（P＜0.05），生物量、株高、根長與POD活性存在極顯著負相關關系（P＜0.01），與CAT活性存在極顯著正相關關系（P＜0.01），葉綠素與CAT活性存在極顯著負相關關系（P＜0.01），與丙二醛含量存在顯著負相關關系（P＜0.05）。氣孔導度與凈光合速率和蒸騰速率存在極顯著正相關關系（P＜0.01），三者與胞間CO2濃度均無顯著相關性（P＞0.05）。凈光合速率與丙二醛含量存在極顯著負相關關系（P＜0.01），凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度與POD活性存在極顯著負相關關系（P＜0.01），與SOD活性和CAT活性無顯著相關性（P＞0.05），胞間CO2濃度與CAT活性存在顯著負相關性（P＜0.05）。丙二醛含量與SOD活性存在顯著負相關關系（P＜0.05），與POD活性存在極顯著負相關關系（P＜0.01），與CAT活性無顯著相關性，SOD、POD、CAT三種酶活性間無顯著相關性（P＞0.05）。

表1 生物炭處理鹽堿脅迫下植物生長生理指標相關性分析Table 1 Correlation analysis of plant growth physiological indexes under saline-alkali stress treated by biochar

3 討 論

3.1 生物炭對鹽堿脅迫下植物生長指標的影響

植物的外部形態(tài)和生長狀況是其受鹽堿脅迫傷害程度的最直觀表現。本研究中黑麥草和紫花苜蓿的生物量以及黑麥草的株高較CK顯著降低，根長無明顯變化，與大部分研究結果相似[25]。鹽漬化土壤中含有過量的Na+，滲入細胞會造成原生質凝聚，破壞葉綠素[26]，使植物的生長減緩或停止，而本研究結果表明，鹽堿脅迫對葉綠素含量無顯著影響，可能是因為本研究鹽堿處理時間僅14 d，短期鹽堿脅迫并未達到脅迫葉綠素的標準，因此葉綠素變化并不明顯。

添加生物炭后黑麥草和紫花苜蓿的生物量、株高顯著增大，表明生物炭可部分緩解鹽堿脅迫所導致的滲透壓脅迫[27-28]，促進植物生長，這與孔祥清、謝迎新等[29-31]關于大豆、小麥以及西紅柿等植物的研究結果一致，但Luo等[32]發(fā)現添加生物炭后對植物生長無效甚至產生負面影響，這可能與施入生物炭的種類以及添加量有關。本研究表明黑麥草和紫花苜蓿的生物量及株高并未隨著生物炭添加量的增加而增加，3%生物碳添加量處理的生物量和株高顯著高于1%和5%生物炭添加量處理，說明生物炭的緩解效應也存在一定的閾值。本研究中，生物炭處理對黑麥草根長無顯著影響，而紫花苜蓿根長隨生物炭施加量增加先增大后減小，且3%生物炭處理的根長顯著高于鹽堿脅迫，可能是因為紫花苜蓿的根系具有根瘤，在較短時間內即可與適宜添加量的生物炭相適應，改善紫花苜蓿的根際環(huán)境，從而增加土壤微生物的豐度和活性[33]，促進養(yǎng)分的吸收，進一步促進紫花苜蓿生長發(fā)育。

3.2 生物炭對鹽堿脅迫下植物光合特性的影響

光合作用是植物制造自身生長所需有機物的主要途徑，具有平衡大氣中氧和二氧化碳的作用，在自然界中具有重要意義[34]。本研究中，黑麥草和紫花苜蓿的胞間CO2濃度及氣孔導度均顯著降低，這與魯強等[26]關于秀麗四照花的研究結果相似，說明植株光合速率降低的主要原因是氣孔限制；氣孔導度與凈光合速率和蒸騰速率存在極顯著正相關關系（P＜0.01），氣孔導度下降進一步引起黑麥草和紫花苜蓿凈光合速率以及蒸騰速率的顯著降低，與大部分研究結果一致[35-36]。

施入生物炭后，黑麥草的胞間CO2濃度隨生物炭施用量增加先增大后減小，3%以及5%生物炭處理的紫花苜蓿胞間CO2濃度顯著高于鹽堿脅迫，此時黑麥草和紫花苜蓿的凈光合速率均顯著高于鹽堿脅迫，說明施入生物炭后，鹽堿脅迫對植物光合作用的抑制得到了有效的緩解，可能是因為添加生物炭能夠改善植物根際環(huán)境，緩解鹽堿脅迫對植物細胞造成的損害，提高植物凈光合速率，這與大部分研究結果相似[37-39]。本研究結果表明，只有3%生物炭處理對紫花苜蓿氣孔導度及蒸騰速率有顯著影響，而各生物炭施用量處理的黑麥草氣孔導度及蒸騰速率均顯著高于鹽堿處理，其中3%生物炭處理的氣孔導度和蒸騰速率最高，造成這種差異可能是短期鹽堿脅迫下，植物光合作用主要受氣孔限制影響，且由其生長環(huán)境中的光照、溫度以及水分等多種因素共同作用，而不同植物對逆境的適應與響應不同，因此對生物炭的響應也不同。本研究中，黑麥草的氣孔導度、蒸騰速率和胞間CO2濃度，紫花苜蓿的氣孔導度及蒸騰速率均隨生物炭施用量的增加呈先增大后減小的趨勢，表明生物炭的施用量并非越多越好，過量的生物炭可能會減小土壤有效孔隙量[40]，影響植物的代謝活動，反而會抑制植物的某些光合特性[41]，適宜的生物炭施用量才能提高植物光合作用，促進植物生長。

3.3 生物炭對鹽堿脅迫下植物抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

鹽堿脅迫會導致植物體內滲透壓升高，打破植物體內離子平衡，破壞細胞膜的結構和功能[42]。MDA是植物在逆境下膜脂過氧化的主要產物，其含量的高低可直接反應膜脂過氧化程度。本研究中，短期鹽堿脅迫下黑麥草和紫花苜蓿的MDA含量顯著高于CK，細胞膜結構遭到破壞，這與劉智微等[23]關于象草的研究結果一致。逆境條件下植物自身會產生相應的應對機制，在植物體內活性氧清除機制中，SOD、POD和CAT是最主要的抗氧化酶，三者通過協同作用清除體內的活性氧，維持體內自由基含量的穩(wěn)態(tài)水平[43-44]，其活性變化可以反應逆境下植物體內的代謝和抗逆性變化。本研究結果顯示，MDA含量與SOD活性呈顯著負相關關系（P＜0.05），且鹽堿脅迫下黑麥草和紫花苜蓿的SOD、POD和CAT活性均顯著提高，說明鹽堿脅迫下，黑麥草和紫花苜蓿短期內即作出積極反應，通過提高抗氧化酶活性，緩解鹽堿脅迫對植物造成的影響，這與蘇丹等[45]的研究結果一致。

添加生物炭后，紫花苜蓿SOD活性顯著提高，但黑麥草的SOD活性無顯著變化，可能是因為，短期內鹽堿脅迫雖顯著提升兩種植物自由基的產生，但豆科植物具有根瘤，可與生物炭有效結合，生物炭的添加更有利于豆科植物對鹽堿脅迫的緩解，提升其SOD活性以促進多余自由基的消除，而對禾本科的緩解作用不明顯。紫花苜蓿中，SOD活性增強必然導致過氧化物H2O2大量生成，但本研究中用于消除H2O2的CAT和POD活性基本降呈降低趨勢，植物的生長狀況卻顯著優(yōu)于鹽堿脅迫，可能是因為有害自由基毒害對紫花苜蓿的影響強于過氧化物H2O2；而對于黑麥草，清除多余自由基的SOD活性無顯著變化，但CAT活性顯著提高，POD活性基本呈降低趨勢，可能是因為CAT和POD具有互補的作用，而在鹽堿脅迫初期，黑麥草清除H2O2以CAT的分解作用為主，周翠香等[46]關于生物炭對鹽地堿蓬抗氧化酶活性影響的研究中也有相似結論。隨生物炭添加量的增加，紫花苜蓿的SOD活性無顯著變化，但POD和CAT活性顯著降低，說明POD和CAT活性對生物炭的敏感程度較SOD更為強烈，且生物炭添加量越大，H2O2的消除越困難，但植物的生長沒有出現受抑制的趨勢，證明自由基對豆科植物的影響強于H2O2。隨生物炭添加量增加，黑麥草的SOD和CAT活性均無顯著變化，但POD活性下降明顯，說明植物體內有機底物呈下降趨勢，同時黑麥草光合速率呈現增長趨勢，可能是因為短期內生物炭對鹽堿脅迫下禾本科植物生長的緩解主要通過改善其組織結構而非有機物的累積。綜上所述，黑麥草和紫花苜蓿幼苗對鹽堿脅迫較為敏感，短期內鹽堿脅迫即對其抗氧化系統產生影響，并抑制其生長及光合作用，而添加生物炭可提高二者抗脅迫能力，促進抗氧化酶系統作出積極響應，結合黑麥草及紫花苜蓿的生物量及光合性能均有所提升，認為適宜的生物炭添加量可有效緩解鹽堿脅迫對黑麥草和紫花苜蓿生長的抑制，3%的生物炭添加量效果最好。研究表明生物炭可改善土壤環(huán)境[17-18]，而本研究只針對鹽堿脅迫初期，黑麥草和紫花苜蓿幼苗為維持生長所做出的響應，關于鹽堿脅迫下施加生物炭對植物生長和土壤環(huán)境變化的耦合研究，還需通過田間試驗深入探究。

4 結 論

1）鹽堿脅迫在初期顯著影響黑麥草和紫花苜蓿的抗氧化酶活性，對細胞膜透性、光合速率和生物量積累具有不同程度的抑制作用，但對葉綠素含量和根長無顯著影響（P＞0.05）。

2）鹽堿脅迫初期，生物炭可有效提高黑麥草和紫花苜蓿的抗脅迫能力，緩解鹽堿脅迫對其生長的抑制作用，3%生物炭處理的生物量、株高、根長較鹽堿脅迫分別 增 加 了48.50%～82.34%、31.19%～44.16%、17.15%～48.09%，氣孔導度、蒸騰速率增加了118.69%～358.99%、98.66%～526.53%，紫花苜蓿的葉綠素含量和凈光合速率分別增加了7.97%和519.09%。

3）鹽堿脅迫下，隨生物炭添加量增大，植物生長指標、光合特性、細胞膜透性以及抗氧化酶活性基本呈現出低添加量促進、高添加量抑制的趨勢，3%的生物炭施用量效果最好。