劉鵬，王偉濤，石磊，李燕，孫偉杰，初慧（解放軍海軍第九七一醫(yī)院.輸血科，.藥劑科，山東青島266071）

常規(guī)ABO血型包括A、B、O、AB型。目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定的ABO血型等位基因有390多種［1］，基因多態(tài)性造成了ABO血型抗原表達(dá)的差異性，從而產(chǎn)生了各類亞型，如A3、AX、Am、B3、BX等，其常規(guī)血清學(xué)檢測常表現(xiàn)為正、反定型結(jié)果不一致，需要進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)檢測及家系調(diào)查，明確其ABO基因型。在臨床工作中，我們對3例血清學(xué)表現(xiàn)為AB亞型的標(biāo)本通過核苷酸序列分析，進(jìn)行血型基因?qū)W檢測，定型為罕見的B（A）04型，并采用配血相合輸血策略，保證了臨床輸血安全。

1 資料與方法

1.1 一般資料 3例標(biāo)本分別來自于臨床術(shù)前常規(guī)血型檢查者，年齡25～40歲，均為男性。既往無特殊病史，無長期用藥史、輸血史、器官移植史。血清學(xué)定型為AweakB亞型，血清中存在不規(guī)則抗A抗體。

1.2 儀器及試劑 Grifols全自動血型分析儀、微柱凝膠卡離心機(jī)及孵育器（西班牙Diana公司），6Y-600C臺式低速離心機(jī)、BY-120A血庫專用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械公司），PAC300電泳儀、C1000 PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），3100-Avant全自動DNA序列分析儀（ABI公司）。

抗A、抗B、反定型紅細(xì)胞、抗A1、抗H、篩選細(xì)胞、抗IgG＋C3d、A2細(xì)胞（上海血液生物醫(yī)藥公司），人源多克隆抗A、抗B（成都協(xié)和公司），抗AB（法國Diagast公司），DG Gel ABO-CDE、DG Gel Coombs微柱凝膠卡（西班牙Diana公司），低離子強(qiáng)度鹽溶液（珠海貝索公司），基因組DNA提取試劑盒（美國Invirtrogen公司），ABO基因分型試劑盒（德國Readygene公司），外顯子6、7直接測序引物（PAGE級）、Ex-Taq試劑盒、單倍體測序LA-Taq試劑、PCR產(chǎn)物專用載體（pMD18-T vetor）（TaKaRa公司）。

1.3 血型血清學(xué)檢查 紅細(xì)胞血型鑒定、不規(guī)則抗體篩查和直接抗人球蛋白試驗按照操作技術(shù)規(guī)范［2-3］和各試劑盒說明書要求進(jìn)行。血型鑒定、抗體篩查分別使用微柱凝膠法和試管法，記錄凝集強(qiáng)度，并用人源抗A、抗B、抗A1、抗AB、A2細(xì)胞和抗H加以進(jìn)一步分析。

1.4 基因?qū)W檢測 基因分型及測序由青島市中心血站輸血研究所協(xié)助完成。

ABO基因組DNA提取及分型：EDTA-K2抗凝全血3 mL，用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA；用紫外分光光度法測定DNA在波長為260 nm和280 nm時的吸光度值，以A260nm／A280nm鑒定DNA純度，該比值應(yīng)在1.8～2.0之間；用ABO基因分型試劑盒進(jìn)行ABO基因分型。

對ABO基因第6、7外顯子進(jìn)行直接測序。根據(jù)參考文獻(xiàn)［4］設(shè)計引物，引物序列見表1。PCR體系為：模板DNA 500 ng，dNTPs 400μmol／L，每條引物0.1μmol／L，DNA Taq酶3 U，10×PCR buffer 5μL，Mg2＋2.5μmol／L，終體系50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性60 s、63℃退火90 s、72℃延伸60 s，10個循環(huán)；94℃變性60 s、61℃退火90 s、72℃延伸60 s，25個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳確定產(chǎn)物特異性。特異性引物與相應(yīng)的靶序列互補(bǔ)而獲得特異性的擴(kuò)增片段，根據(jù)產(chǎn)物的有無來判斷目的序列的有無，通過ABI3100-Avant全自動DNA序列分析儀進(jìn)行PAGE電泳，根據(jù)產(chǎn)生的不同熒光強(qiáng)度，軟件分析序列數(shù)據(jù)。

表1 ABO基因第6、7外顯子PCR直接測序引物

單倍體序列分析：用LA-Taq酶特異性擴(kuò)增ABO基因外顯子6、7和內(nèi)顯子6，PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T vetor T載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，用青霉素對含重組質(zhì)粒的菌落進(jìn)行篩選，挑取10個陽性克隆，擴(kuò)增細(xì)菌，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序鑒定，確定樣本的單體型。

序列比對與分析：用Chromas軟件讀取測序結(jié)果，結(jié)果與GenBank中NC＿000009.11序列對比，根據(jù)ABO等位基因庫將A101、B101序列定為標(biāo)準(zhǔn)序列，用Gene Runner軟件進(jìn)行分析，確定基因型。各個B（A）基因突變點比較見表2。

表2 各個B（A）基因突變點的比較

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)檢測結(jié)果 見表3。3例標(biāo)本血清學(xué)特點相似，正定型均為A弱B強(qiáng)型，抗AB凝集為4＋。反定型存在不規(guī)則抗A抗體，與A1細(xì)胞凝集強(qiáng)度為2＋～3＋，與A2細(xì)胞有弱凝集。紅細(xì)胞表面H抗原與正常O型相當(dāng)，比正常B型明顯增強(qiáng)。與血型亞型表比較，推測可能為B（A）或Cis-AB型。

表3 3例標(biāo)本血型血清學(xué)檢測結(jié)果

2.2 血型基因?qū)W檢測 3例標(biāo)本基因型均為B／O1雜合型，與血清學(xué)結(jié)果不一致。

2.3 直接測序結(jié)果 標(biāo)本2、3 ABO基因外顯子6表現(xiàn)為261G／delG和297A／G雜合，外顯子7表現(xiàn)為526C／G、640A／G、657C／T、703G／A、796C／A、803G／C、930G／A、1096G／A雜合；標(biāo)本1 ABO基因外顯子6表現(xiàn)為261G／delG雜合和297G／G純合，外顯子7表現(xiàn)為526C／G、640A／G、646A／T、657C／T、681A／G、703G／A、771C／T、796C／A、803G／C、829A／G、930G／A、1096G／A雜合；除640A／G外，其他幾個位點均是B101、O01、O02等位基因常見位點，且經(jīng)直接測序暫不能確定640A／G位突變點位于O還是B等位基因，見圖1。

圖1 直接測序結(jié)果

2.4 ABO基因第6、7外顯子單體型測序結(jié)果 標(biāo)本2、3結(jié)果顯示，其中一條單體型為O01，另外一條與B101對比，在第640位堿基發(fā)生A＞G突變，基因型為B（A）04／O01；標(biāo)本1結(jié)果顯示，一條單體型為O02，另外一條與B101對比，在第640位堿基發(fā)生A＞G突變，基因型為B（A）04／O02。

2.5 交叉配血結(jié)果 與多份A、AB型紅細(xì)胞交叉配血主側(cè)凝集為3＋～4＋，與多份B、O型紅細(xì)胞交叉配血次側(cè)弱凝集，故予以輸注O型洗滌紅細(xì)胞及AB型新鮮冰凍血漿，患者輸注有效且未出現(xiàn)輸血反應(yīng)。

3 討論

1990年，Yamamoto等［5］成功克隆了編碼A1糖基轉(zhuǎn)移酶的基因并進(jìn)行了測序，其后編碼ABO血型物質(zhì)的其他等位基因序列相繼研究清楚。ABO血型的遺傳規(guī)律遵守孟德爾遺傳方式，其遺傳座位在第9號染色體的長臂3區(qū)4帶（9q34.1-9q34.2），包含編碼序列共1 062個堿基。ABO基因有7個外顯子，其中6、7外顯子占編碼區(qū)的90%以上，編碼酶全部的催化區(qū)，決定了糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性和性質(zhì)，直接影響A抗原和B抗原的表達(dá)，通常作為亞型基因定型的首選檢測區(qū)域。ABO抗原是ABO基因編碼的N－乙酰氨基半乳糖或D－半乳糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移糖體殘基至H物質(zhì)上，形成A或B抗原。A101和B101兩個等位基因高度同源，僅有幾個堿基的差異。其中526C／G、703G／A、796C／A、803G／C導(dǎo)致4個關(guān)鍵氨基酸（A176G、G235S、L266M 和 G268A）（Arg176Gly、Gly 235Ser、Leu266Met和Gly268Ala）的替換。其中176A、235G、266L和268G四個氨基酸決定糖基轉(zhuǎn)移酶A（Glycoslytransferase A，GTA）特異性，176G、235S、266M和268A 4個氨基酸決定糖基轉(zhuǎn)移酶B（Glycoslytransferase B，GTB）特異性。目前將526C＋703G＋796C＋803G 4個氨基酸組成的單倍體稱為AAAA型，526G＋703A＋796A＋803C組成的單倍體稱為BBBB型。

B（A）亞型是一種較為罕見的血型亞型，由Yamamoto等［5］報 道，全 世 界 人 群 發(fā) 生 率 為1／580 000～1／170 000。目前紅細(xì)胞血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫已經(jīng)公布的B（A）等位基因有6種類型［1］，變異的B基因在正常B等位基因基礎(chǔ)上發(fā)生錯義突變，具有編碼雙功能活性的酶的能力，所以血清學(xué)除了表現(xiàn)B抗原的特異性外還表現(xiàn)除了少量的A抗原特異性。我國目前報道的B（A）亞型等位基因主要集中在B（A）02和B（A）04［6］。本次發(fā)現(xiàn)的3例根據(jù)血清學(xué)檢測結(jié)果，初步推斷為AB亞型，經(jīng)過基因測序確定為B（A）／O亞型，均為B（A）04型，基因型存在nt640A＞G點突變，導(dǎo)致214位甲硫氨酸被纈氨酸置換，為我國目前報道的主要亞型。

B（A）亞型用普通的血清學(xué)檢測方法難以正確定型，而且與A亞B或CisAB亞型血清學(xué)格局相似，易混淆。CisAB與B（A）型均是較為罕見的AB亞型，人群中發(fā)生頻率很低。CisAB最早報道于1964年［5］，目前共報道9種CisAB等位基因［1］。在遺傳機(jī)制上與B（A）一樣，現(xiàn)在把這二類具有相似表達(dá)的ABO血型歸納為一類，稱為雙重復(fù)合型ABO糖基轉(zhuǎn)移酶血型基因［7］。A或B等位基因上，發(fā)生1個或者2個堿基突變，基因編碼了一個既具有A酶催化功能又具有B酶催化功能的糖基轉(zhuǎn)移酶［8］。A／B抗原上有了一些B／A抗原，血清學(xué)上二者表現(xiàn)型的抗原含量有偏重，兩者的遺傳方式相似，應(yīng)進(jìn)行分子生物學(xué)診斷。B（A）／O亞型特點：（1）血清型定型為AB亞型，一般為AweakB。紅細(xì)胞上有少量的A抗原和幾乎含量正常的B抗原；（2）血清中常?？笰，可凝集A1細(xì)胞與部分A2細(xì)胞；（3）B（A）／O亞型紅細(xì)胞與抗H反應(yīng)強(qiáng)度接近O細(xì)胞，比正常的B細(xì)胞與抗H的反應(yīng)明顯增強(qiáng)，而B（A）／B亞型紅細(xì)胞與抗H反應(yīng)無增強(qiáng)；（4）存在順式遺傳方式，B（A）型與CisAB型均為一條DNA鏈上同時包含A和B等位基因，B（A）型包含2條基因，其中1條B基因有A酶的突變點（BABB、BBBA、BBBB），與另外1條為未知基因（通常為O）。CisAB／O亞型特點：（1）紅細(xì)胞絕大多數(shù)表現(xiàn)為A2BX，以A抗原為主，B抗原較弱；（2）血清中含有弱抗原的相應(yīng)不規(guī)則抗體抗A1，且凝集強(qiáng)度較弱；抗H反應(yīng)強(qiáng)于B細(xì)胞，與O型細(xì)胞相當(dāng)；（3）存在順式遺傳方式，1條A基因有B酶突變點（AAAB，BBAB），另外1條為未知基因（通常為O），目前已報道的CisAB遺傳機(jī)制均為在A基因的基礎(chǔ)上發(fā)生糖基轉(zhuǎn)移酶基因的錯義突變，從而編碼具有雙功能活動的酶。A亞B型血清學(xué)特點：（1）A抗原凝集強(qiáng)度多＜2＋，B抗原正常4＋；（2）血清中可能存在凝集強(qiáng)度較弱的抗A1不規(guī)則抗體，與A側(cè)亞型具體分型相關(guān)；（3）通常與抗H發(fā)生弱凝集，如果發(fā)現(xiàn)H抗原很強(qiáng)，則很可能是B（A）或CisAB亞型［9］；（4）分子基礎(chǔ)是表達(dá)A酶的基因出現(xiàn)了突變，而B酶的基因正常。A亞B型是1條A亞基因與1條B基因。三類AB亞型的鑒別，應(yīng)采用血型血清學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行疑難血型鑒定，并在條件允許下對家系進(jìn)行檢測［10］。

根據(jù)血清學(xué)及基因?qū)W結(jié)果顯示，此類患者最好同型輸注，但是血型一致的獻(xiàn)血員較為少見，一般情況下紅細(xì)胞可輸注O型或B型洗滌紅細(xì)胞，血漿考慮AB型血漿或低效價B型血漿。B（A）型獻(xiàn)血員紅細(xì)胞經(jīng)過洗滌后，可以輸注給AB型患者。由于目前臨床上使用的血型試劑為高效價的單克隆試劑，很多亞型的弱凝集增強(qiáng)，具有高反應(yīng)性，應(yīng)加用多克隆抗體人源血清。當(dāng)血清學(xué)檢測結(jié)果不符合孟德爾遺傳規(guī)律時，應(yīng)采用分子診斷技術(shù)進(jìn)行輔助診斷，以確保臨床輸血安全。

致謝：感謝青島市中心血站輸血醫(yī)學(xué)研究所在分子生物學(xué)鑒定中給予技術(shù)支持和幫助！