王詩雨,李莉娟,黃梅,郭曉嘉,張連生(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院血液科,蘭州730030)
β2-糖蛋白Ⅰ(β2-glycoprotein I,β2-GPⅠ)是一種由肝細胞合成的糖蛋白,在血漿中根據(jù)其功能活性的不同以游離形式和脂蛋白相關(guān)形式存在。抗β2-GPⅠ抗體是抗磷脂抗體綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)最具特征的抗體之一,其與抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibody,aCL)及狼瘡抗凝物質(zhì)(Lupus anticoagulant,LA)等其他磷脂或磷脂復(fù)合物共同組成了抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody,aPL)。許多健康人的血漿中有低滴度、低親和力的天然抗β2-GPⅠ抗體,其血漿濃度隨著年齡的增長而增加[1-2]。
現(xiàn)有研究表明,β2-GPⅠ在調(diào)節(jié)出凝血、補體、血管生成及免疫等方面具有重要作用,其作為一種存在于血漿中的多功能磷脂結(jié)合糖蛋白,對β2-GPⅠ功能的研究可能對臨床上多種血液系統(tǒng)疾病的輔助診斷、治療及預(yù)后判斷有重要價值。在檢驗方面,分離純化β2-GPⅠ對研究其功能具有重要意義,臨床上對抗β2-GPⅠ抗體的檢測也逐漸從ELISA過度到靈敏度及特異性更高的化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)。
本文從β2-GPⅠ的結(jié)構(gòu)入手,綜述了β2-GPⅠ的作用、β2-GPⅠ及其抗體相關(guān)檢測方法、其在血液系統(tǒng)疾病中的研究進展,為進一步輔助臨床診斷及治療提供一定依據(jù)。
β2-GPⅠ屬于補體控制蛋白超家族,由5個高度同源補體控制結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成,即結(jié)構(gòu)域Ⅰ(DomainⅠ,DⅠ)-結(jié)構(gòu)域Ⅴ(DomainⅤ,DⅤ)[3]。研究表明,β2-GPⅠ在血漿中至少有“O”、“J”、“S”三種構(gòu)型;游離狀態(tài)時,DⅠ和DⅤ之間相互作用形成閉合的環(huán)狀“O”型;當(dāng)遇到暴露的陰性磷脂表面時,由于DⅤ與陰性磷脂親和性強,閉合環(huán)狀會打開,并形成魚鉤狀結(jié)構(gòu)“J”型,錨定在陰性磷脂表面,DⅠ此時可完全暴露,“J”型可能是β2-GPⅠ在血漿中的活性形式[4-5]。
β2-GPⅠ在機體中的構(gòu)型變化可由分子相互作用、翻譯后修飾、遺傳改變或內(nèi)環(huán)境變化引起,這種構(gòu)型上的轉(zhuǎn)化暴露了DⅠ中的隱秘表位,從而使抗β2-GPⅠ抗體與之結(jié)合,β2-GPⅠ抗原抗體復(fù)合物的形成會導(dǎo)致自身免疫病患者血栓形成風(fēng)險增加[4,6]。有學(xué)者認(rèn)為β2-GPⅠ可能存在幾種中間形式,這些中間形式可能導(dǎo)致了β2-GPⅠ在機體內(nèi)的多種反應(yīng)活性,但這些中間形式的穩(wěn)定性及作用目前還亟待研究。β2-GPⅠ的大致結(jié)構(gòu)如圖1。
圖1 β2-GPⅠ的“O”型及“J”型結(jié)構(gòu)及其與抗體的可能結(jié)合方式
2.1 調(diào)節(jié)出凝血 β2-GPⅠ不僅具有抗凝作用,還具有促凝及調(diào)節(jié)血小板的作用,其對出凝血的調(diào)節(jié)平衡取決于周圍環(huán)境,但機體中這種平衡是如何維持的目前尚不清楚,并且β2-GPⅠ在血液中的各種作用并不是獨立存在的,各種作用之間可能互相影響。
2.1.1 抗凝作用 β2-GPⅠ作為一種磷脂結(jié)合糖蛋白,具有生理抗凝劑的作用,其可以下調(diào)凝血酶生成、抑制凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白生成和血小板聚集,并可以抑制血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物形成,使正常血漿中的活化的部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)延長[7-9]。但在疾病狀態(tài)中,其多表現(xiàn)為促凝作用。
2.1.2 促凝作用 對APS的研究表明,β2-GPⅠDⅠ的表位甘氨酸40-精氨酸43(Glycine 40-Arginine 43,G40-R43)主要負(fù)責(zé)結(jié)合血栓形成相關(guān)的抗體,可能與其促凝作用密切相關(guān)[10]。β2-GPⅠ可通過抑制蛋白C活化和破壞抗凝血膜聯(lián)蛋白Ⅴ(annexin 5)的晶體防護層來實現(xiàn)其促凝作用[8]。臨床上,抗β2-GPⅠDⅠ和抗磷脂酰絲氨酸/凝血酶原抗體及aCL等aPL的共存提示嚴(yán)重的血栓形成風(fēng)險,對存在血栓形成風(fēng)險的患者,需積極予以監(jiān)測aPL水平及出凝血指標(biāo)[11-12]。Kelchtermans等[13]對抗β2-GPⅠ抗體類別的meta分析表明,抗β2-GPⅠIgG與血栓形成的相關(guān)性更高,但在少數(shù)疾病中抗β2-GPⅠIgM與血栓形成更為相關(guān)。
2.1.3 調(diào)節(jié)血小板作用 β2-GPⅠ具有調(diào)節(jié)血小板的作用,這種調(diào)節(jié)作用會對出凝血產(chǎn)生不同程度的影響。在疾病狀態(tài)中,β2-GPⅠ抗原抗體復(fù)合物的形成可以激活血小板受體如糖蛋白Ⅰb-α(glycoproteinⅠb-α,GPⅠb-α)、載脂蛋白E受體2(apolipoprotein E receptor 2,ApoER2)、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)和血小板糖蛋白受體Ⅵ(glycoproteinⅥ,GPⅥ)等,并與血小板因子4(platelet factor4,PF4)相互作用,從而影響血小板活化,而血小板活化后會表達組織因子(tissue factor,TF),并釋放其他不同的促凝介質(zhì),促進血栓的形成,乙酰肝素酶抑制劑可以抑制這一過程;在另一方面,β2-GPⅠ能夠抑制血小板與血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的結(jié)合,干擾vWF依賴性血小板粘附,進而抑制血栓形成[14-18]。這種促凝與抗凝的反向作用體現(xiàn)了β2-GPⅠ在調(diào)節(jié)出凝血平衡中的重要性。
2.2 調(diào)節(jié)補體 β2-GPⅠ屬于補體控制蛋白超家族,其在體內(nèi)外均有補體調(diào)節(jié)作用,其在生理上對補體的調(diào)節(jié)程度是未知的[8]。Gropp等[19]認(rèn)為β2-GPⅠ具有作為補體抑制的輔助因子的作用,其可通過經(jīng)典及旁路兩種不同的途徑抑制補體激活,“J”型β2-GPⅠ可以更好的結(jié)合C3,為補體因子H提供結(jié)合位點,從而介導(dǎo)補體因子Ⅰ對C3降解及C3b裂解,在調(diào)節(jié)補體中起重要作用。aPL對補體的激活會產(chǎn)生C5a,從而誘導(dǎo)中性粒細胞組織因子依賴性促凝活性[20]。β2-GPⅠ這種對補體的調(diào)節(jié)作用可能使其參與了血栓形成及炎癥免疫等多種機體反應(yīng)。
2.3 調(diào)節(jié)血管生成 β2-GPⅠ對血管生成的調(diào)節(jié)作用同樣取決于DⅠ。研究顯示,β2-GPⅠ對血管生成的調(diào)節(jié)作用有劑量依賴性,N-β2GPⅠ(nickedβ2-GPⅠ)在較低濃度下具有血管生成特性,在較高濃度下則具有抗血管生成特性[21]。一方面,β2-GPⅠ可以下調(diào)內(nèi)皮細胞上的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受體激酶插入域受體/胎肝激酶1(kinase insert domain receptor/fetal liver kinase 1,KDR/Flk1)的表達,并阻止絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinases/extracellular signal-regulated kinase,MAPK/ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合酶激酶-3β(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinaseB/glycogen synthase kinase-3β,PI3K/Akt/GSK3β)途徑中VEGF下游效應(yīng)分子的磷酸化;另一方面,β2-GPⅠ衍生的肽還以劑量依賴性反應(yīng)增加了可溶性fms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase 1,sFlt-1)的表達,從兩個方面起到了抗血管生成的作用[22-24]。β2-GPⅠ的這種抗血管生成作用可能在實體腫瘤治療中有一定價值。
2.4 調(diào)節(jié)免疫 β2-GPⅠ具有結(jié)合并中和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的能力,其與LPS的結(jié)合可以直接或間接觸發(fā)凝血,在感染免疫中具有一定的調(diào)節(jié)作用。體外研究證實,β2-GPⅠ可以抑制LPS誘導(dǎo)的單核細胞和內(nèi)皮細胞表達促炎因子,對炎癥有負(fù)性調(diào)控作用;另一方面,β2-GPⅠ及其抗體釋放的信號可以刺激內(nèi)皮細胞釋放出微粒/細胞外囊泡,這些微粒/囊泡可以以自分泌或旁分泌的方式刺激周圍的靜止細胞,進而有一定的促炎作用[25]。感染患者β2-GPⅠ水平與C反應(yīng)蛋白(C reaction protein,CRP)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎癥指標(biāo)水平及體溫呈顯著負(fù)相關(guān),因此高水平的β2-GPⅠ可能抑制了炎癥進展,并且可以作為感染程度的判定指標(biāo)之一[26-27]。
此外,β2-GPⅠ在細胞免疫中也起到一定程度作用。體外研究表明樹突狀細胞(dendritic cell,DC)可以將β2-GPⅠ衍生的肽呈遞給T細胞,并激活β2-GPⅠ反應(yīng)性CD4+T細胞的增殖和活化,導(dǎo)致Th1細胞因子如γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)為主的產(chǎn)生,并可以促進B細胞產(chǎn)生抗β2-GPⅠ抗體,形成抗原抗體復(fù)合物導(dǎo)致動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生[6,28-29]。He等[30]研究表明β2-GPⅠ可以促進骨髓衍生樹突狀細胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)的增殖,DC分泌的細胞因子和DC-T細胞相互作用可以增強β2-GPⅠ誘導(dǎo)的Th2分化,導(dǎo)致部分患者的免疫失衡。DC、T細胞和B細胞在APS患者針對β2-GPⅠ的免疫反應(yīng)的啟動和持續(xù)中起著重要作用。對于存在血栓形成高危因素的患者,可以同時檢測β2-GPⅠ及淋巴細胞亞群的水平,預(yù)測血栓形成風(fēng)險。
β2-GPⅠ是由肝細胞合成的具有326個氨基酸的單鏈蛋白,平均相對分子量(M r)為54 200,人血漿含量約為200 μg/mL[3]。獲得純化β2-GPⅠ對研究其功能有重要意義,純化β2-GPⅠ常用的方法是通過高氯酸沉淀,但高氯酸可能會影響分子的完整性,而利用聚乙二醇(PEG)4000沉淀配合Heparin-Sepha-rose CL-6B親和層析和Source 15S離子交換層析的方法可以有效地從人血漿中提取純度>95%的完整β2-GPⅠ[1,31]。將純化的人β2-GPⅠ用DL-二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)激活的硫氧還蛋白-1(Thioredoxin-1,TRX-1)脫氧,然后用谷胱甘肽(Glutathione,GSH)來阻斷游離硫醇,可以在體外獲得穩(wěn)定的還原β2-GPⅠ,這種還原的β2-GPⅠ在體外具有天然生物活性,并具有抗氧化應(yīng)激和抗炎能力,有助于對其功能的進一步研究[32]。
抗β2-GPⅠ抗體作為APS重要的抗體之一,在臨床上主要的檢測方法是ELISA,其過程繁瑣,需要75~80 min進行樣本溫育、酶結(jié)合物溫育及底物溫育等步驟,但ELISA對設(shè)備儀器條件及操作人員水平要求不高。2019年《抗磷脂抗體檢測的臨床應(yīng)用專家共識》指出可以應(yīng)用CLIA對抗β2-GPⅠ抗體進行檢測,CLIA是一種全自動的方法,并且僅需20~25 min孵育及Meg-wash(利用磁力分離技術(shù)清洗掉無用底物)即可讀取結(jié)果,較ELISA更快捷,并具有更高的靈敏度、特異性及準(zhǔn)確性,可以提高抗體的檢出率,但費用昂貴,因此在臨床上較少應(yīng)用,可作為ELISA的一種替代方法[33-34]。此外,還有斑點印記檢測法、薄層色譜法等,由于靈敏度較差及檢測流程復(fù)雜被淘汰[35-36]。
4.1 免疫性血小板減少癥 免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是一種以自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞和代償性血小板生成不足為特征的疾病,該抗體可加速血小板破壞并抑制其產(chǎn)生。對具有抗GPⅡb/Ⅲa抗體的ITP患者體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn),低水平的β2-GPⅠ與補體激活能力增強相關(guān),β2-GPⅠ可以作為抗GPⅡb/Ⅲa介導(dǎo)的ITP治療的潛在診斷生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[37]。
有10%~70%的ITP患者出現(xiàn)一種或多種aPL陽性,具體取決于疾病的活動程度[38]。Dayama等[39]研究表明,在約12%的ITP患者中檢測到aPL陽性,其中以慢性ITP患者比例最高,并以抗β2-GPⅠ抗體最為常見,慢性ITP患者的血漿抗β2-GPⅠIgG水平升高,并與激素耐藥顯著相關(guān),抗β2-GPⅠ抗體可能是ITP患者APS或其他自身免疫病進展風(fēng)險的影響因素,并可以作為激素治療反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)之一[40]。2020版中國ITP治療指南[41]提出,合并GPⅠb特異性自身抗體陽性的ITP患者使用丙種球蛋白的治療效果不佳,建議有條件的患者檢測糖蛋白特異性自身抗體,有助于丙種球蛋白的療效預(yù)判。
目前并未發(fā)現(xiàn)除ITP外的其他血液系統(tǒng)自身免疫相關(guān)疾病與β2-GPⅠ及其抗體的相關(guān)研究,對于其他血液系統(tǒng)自身免疫性疾病是否具有相關(guān)性,仍需進一步研究。
4.2 白血病 體外研究表明,用β2-GPⅠ抗原抗體復(fù)合物處理單核細胞或THP-1細胞可以增加TF、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)以及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)的表達,TLR4及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有助于上述作用的形成[42-43]。β2-GPⅠ可能因其調(diào)節(jié)出凝血及抗血小板的作用參與了白血病的疾病進展,目前對于β2-GPⅠ在白血病的研究僅限于對急性髓系白血病THP-1細胞系及相關(guān)信號通路,對其在臨床上的應(yīng)用研究相對較少,針對不同類型白血病β2-GPⅠ是否有某種確切意義仍需相關(guān)實驗佐證。
4.3 淋巴瘤 小樣本研究表明新診斷的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma,NHL)患者抗β2-GPⅠ抗體水平升高,以IgA及IgM升高為主,抗β2-GPⅠ抗體的升高與無事件生存期(events free survival,EFS)縮短呈正相關(guān)[44-45]。NHL患者可能確實存在抗β2-GPⅠ抗體等aPL的升高,但不一定會增加患者的血栓形成風(fēng)險,并與疾病的嚴(yán)重程度,血栓形成風(fēng)險,治療結(jié)果或總體生存率無關(guān)[46-47]。
目前對于抗β2-GPⅠ抗體在淋巴瘤中的作用觀點不盡相同,但我們建議對于抗β2-GPⅠ抗體陽性的腫瘤患者,在初始治療期間應(yīng)考慮進行預(yù)防性抗凝治療,以預(yù)防血栓栓塞事件的發(fā)生。
目前對于β2-GPⅠ的研究主要集中在APS,其在機體中具有調(diào)節(jié)出凝血、調(diào)節(jié)補體、調(diào)節(jié)血管生成及參與免疫調(diào)節(jié)等多重作用,仍具有很大的研究空間。目前在臨床檢驗方面,CLIA法的使用很大程度上提升了抗β2-GPⅠ抗體檢測的效率及準(zhǔn)確性。根據(jù)β2-GPⅠ在不同疾病及宿主功能不同,給與針對性的治療將有助于預(yù)防血栓形成、炎癥感染及疾病進展等。β2-GPⅠ作為潛在的新型治療靶點,其在血液系統(tǒng)出凝血疾病及自身免疫相關(guān)性疾病中具有一定的研究價值,并且對其免疫調(diào)節(jié)功能的研究將有助于炎癥調(diào)控及部分血栓栓塞性疾病的風(fēng)險預(yù)測。