秦東芳，龔珂，王學(xué)晶，張曼（.北京大學(xué)民航臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科，北京0023；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院檢驗(yàn)中心，北京00038；3.尿液細(xì)胞分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京00038）

我國(guó)腎結(jié)石發(fā)病率為5.8%，尤其某些南方地區(qū)可高達(dá)10%［1］。該病復(fù)發(fā)率高，給家庭和社會(huì)都帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。腎結(jié)石患者多伴有不同程度的代謝異常，如高鈣尿、高草酸尿、高尿酸尿和低枸櫞酸尿等。研究表明，伴有代謝異常的結(jié)石患者，其復(fù)發(fā)率要高于無(wú)代謝異常的患者［3］。歐洲泌尿外科學(xué)會(huì)（EAU）指南［4］和亞洲泌尿外科學(xué)會(huì)（AUA）指南［5］均建議對(duì)復(fù)發(fā)高風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)石患者進(jìn)行代謝評(píng)估，其中最主要就是24 h尿液成石危險(xiǎn)因素分析。我國(guó)學(xué)者也推薦對(duì)于結(jié)石復(fù)發(fā)高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行血、尿代謝物的評(píng)估［6］。

草酸和枸櫞酸等小分子物質(zhì)檢測(cè)可能受到較多的干擾，尤其草酸鹽溶解度低，還受到維生素C等草酸前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響［7］。近期研究表明［8］，即使是國(guó)際著名的醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室測(cè)量同一份樣本，也會(huì)因方法學(xué)和樣本前處理不同，導(dǎo)致草酸測(cè)量結(jié)果差異很大。因此，采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的樣本前處理方法以及性能良好的檢測(cè)方法，其測(cè)量結(jié)果方可準(zhǔn)確評(píng)估患者的代謝情況，也可以在不同的研究中進(jìn)行比較。

北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科團(tuán)隊(duì)2017年建立了檢測(cè)尿液草酸和枸櫞酸的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）方法，建立了泌尿系結(jié)石代謝評(píng)估數(shù)據(jù)庫(kù)并開(kāi)展長(zhǎng)期追蹤研究［9-11］。相對(duì)于質(zhì)譜法，酶法適用范圍更廣。本研究將對(duì)酶法檢測(cè)尿液草酸和枸櫞酸的分析前因素和性能進(jìn)行探討，以保證測(cè)量結(jié)果具有準(zhǔn)確性、可比性，為將來(lái)用于結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)分層、健康管理，以及制定相關(guān)共識(shí)指南打下良好的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 7600全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；草酸酶法檢測(cè)試劑盒及配套校準(zhǔn)品及質(zhì)控品（批號(hào)32395，BioSystems公司）；枸櫞酸酶法檢測(cè)試劑盒及配套校準(zhǔn)品及質(zhì)控品（批號(hào)2032019002AC，重慶博士泰公司）。

1.2 精密度和正確度驗(yàn)證

1.2.1 驗(yàn)證物質(zhì) 采用中國(guó)計(jì)量院草酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)BWZ8042-2016（標(biāo)準(zhǔn)值：0.199 7 mol／L，約8 990.50 mg／L）和枸櫞酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)BWZ8040-2016（標(biāo)準(zhǔn)值2.00%，約95.18 mmol／L）。用純水稀釋得到1水平，廠商提供的質(zhì)控品作為2水平，分別分裝15份，于－20℃保存，用于精密度驗(yàn)證。上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用純水經(jīng)倍比稀釋得到低、高2濃度水溶液，各分裝10份，于－20℃保存，用于正確度驗(yàn)證。

1.2.2 驗(yàn)證方法 參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS／T 492—2016［12］文件方案，將精密度驗(yàn)證物質(zhì)連續(xù)測(cè)定5 d，每天測(cè)定3次，分別計(jì)算2個(gè)水平的重復(fù)性及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度，評(píng)價(jià)其精密度水平；將正確度驗(yàn)證物質(zhì)連續(xù)測(cè)定5 d，每天測(cè)定2次，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差、偏倚以及均值的95%置信區(qū)間。

1.3 線性范圍驗(yàn)證

1.3.1 線性范圍驗(yàn)證物質(zhì) 將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)倍比稀釋得到的H草酸（濃度約210 mg／L）和L草酸（濃度約1.6 mg／L）、H枸櫞酸（濃度約17.85 mmol／L）和L枸櫞酸（濃度約0.19 mmol／L）分別按一定體積比配制成不同濃度梯度的樣品，進(jìn)行草酸和枸櫞酸的線性范圍驗(yàn)證。

1.3.2 線性范圍驗(yàn)證方法 參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS／T 408—2012［13］文件方案，將H和L按H、5H∶1L、4H∶2L、3H∶3L、2H∶4L、1H∶5L、L制成7個(gè)濃度梯度的樣本，每一濃度重復(fù)測(cè)量3次，檢查離群值和重復(fù)性，計(jì)算均值。用SPSS軟件分別擬合一次、二次和三次多項(xiàng)式方程，判斷線性。

1.4 干擾實(shí)驗(yàn)

1.4.1 干擾物質(zhì) 用純水破壞洗滌紅細(xì)胞，制成系列濃度的血紅蛋白干擾物質(zhì)。采用北京柏定公司總蛋白標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，稀釋后制成系列濃度總蛋白干擾物質(zhì)，用于干擾驗(yàn)證。

1.4.2 干擾驗(yàn)證方法 根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS／T 416—2013《干擾實(shí)驗(yàn)指南》［14］，將標(biāo)準(zhǔn)干擾物與不同濃度尿液標(biāo)本以1∶19的比例混合，每一濃度重復(fù)測(cè)量3次，計(jì)算均值和偏倚。

1.5 分析前影響因素評(píng)價(jià)

1.5.1 樣本來(lái)源 選取北京大學(xué)民航臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科當(dāng)日剩余尿液標(biāo)本。

1.5.2 放置時(shí)間和溫度對(duì)草酸和枸櫞酸濃度的影響 不加任何防腐劑，將尿液分別置于室溫、4℃和－20℃保存24 h。室溫和4℃保存的標(biāo)本分別在0、2、4、8、24 h各測(cè)量1次，－20℃保存的標(biāo)本在24 h測(cè)量1次。以室溫0 h為對(duì)照，比較24 h內(nèi)尿液草酸和枸櫞酸濃度變化情況。

1.5.3 尿液前處理方法的探討 將20例無(wú)結(jié)石對(duì)照者和20例泌尿系結(jié)石患者的隨機(jī)尿液標(biāo)本，一組按100∶1和50∶1的比例即刻加入6 mol／L HCl后室溫保存24 h，另一組于室溫24 h后再分別按100∶1和50∶1的比例加入6 mol／L HCl。比較不同時(shí)間、加入不同劑量HCl對(duì)草酸和枸櫞酸測(cè)定的影響。

1.5.4 標(biāo)本凍存穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 收集24 h尿液當(dāng)日剩余標(biāo)本，每例分裝6份，1份于當(dāng)天檢測(cè)草酸和枸櫞酸，剩余凍存于－20℃，分別于1、3、7、14、30 d時(shí)檢測(cè)草酸和枸櫞酸，檢測(cè)前按50∶1的比例加入6 mol／L HCl酸化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用excel和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的資料以ˉx±s表示，用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度和正確度驗(yàn)證 由于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)尚未規(guī)定草酸和枸櫞酸的精密度和正確度質(zhì)量指標(biāo)，故根據(jù)文獻(xiàn)［15］，草酸以小于1／2 24 h尿草酸基于生物學(xué)變異的不精密度范圍（10.7%）和允許偏倚（5.9%）作為本研究的性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，枸櫞酸則以不精密度5%和偏倚5%作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以保證臨床可接受。

草酸和枸櫞酸試劑的精密度和正確度驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表1、2。草酸的不精密度＜10.7%，枸櫞酸的不精密度＜5%，均可滿足臨床應(yīng)用。草酸和枸櫞酸2個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)量結(jié)果顯示，測(cè)量均值的95%置信區(qū)間均覆蓋驗(yàn)證物質(zhì)賦值。草酸的偏倚＜5.9%，枸櫞酸的偏倚＜5%，測(cè)定結(jié)果在允許范圍內(nèi)。

表1 草酸和枸櫞酸酶法試劑的精密度驗(yàn)證

表2 草酸和枸櫞酸酶法試劑的正確度驗(yàn)證

2.2 線性范圍驗(yàn)證 草酸線性驗(yàn)證最佳擬合方程為一次方程Y＝0.993X－0.216（R2＝0.999，P＜0.001），理論值與實(shí)測(cè)值的平均偏差為1.54%，在1.65～210.71 mg／L范圍內(nèi)線性良好，略優(yōu)于廠商聲明的線性范圍（1.8～180 mg／L）。

枸櫞酸線性驗(yàn)證最佳擬合方程為一次方程Y＝0.953X＋0.044（R2＝0.999，P＜0.001），理論值與實(shí)測(cè)值平均偏差為4.99%，在0.19～17.85 mmol／L范圍內(nèi)線性良好，也優(yōu)于廠商聲明的線性范圍（0.2～13 mmol／L）。

2.3 干擾實(shí)驗(yàn) 見(jiàn)表3、4。以偏倚＜10%為干擾判定標(biāo)準(zhǔn)。血紅蛋白干擾與草酸和枸櫞酸的濃度有關(guān)，高濃度下抗干擾性更強(qiáng)，低濃度時(shí)易受干擾。對(duì)高濃度草酸，血紅蛋白干擾的臨界值為2 g／L，但低濃度時(shí)僅為1 g／L。對(duì)于高濃度枸櫞酸，血紅蛋白干擾的臨界值為5 g／L，但低濃度時(shí)為3 g／L?？偟鞍诪?.5 g／L以下時(shí)對(duì)草酸和枸櫞酸均沒(méi)有干擾。

表3 血紅蛋白和總蛋白對(duì)草酸檢測(cè)的干擾

表4 血紅蛋白和總蛋白對(duì)枸櫞酸檢測(cè)的干擾

2.4 分析前影響因素評(píng)價(jià)

2.4.1 放置時(shí)間及溫度對(duì)尿液草酸和枸櫞酸濃度的影響 見(jiàn)表5。室溫和4℃條件下，不加任何防腐劑，放置0、2、4、8、24 h測(cè)得的草酸濃度和枸櫞酸濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。2 h后草酸濃度即明顯降低。枸櫞酸在室溫和4℃放置24 h的平均變化分別為3.33%和2.67%，比較穩(wěn)定。－20℃保存24 h后，草酸濃度［（17.24±3.56）mg／L］顯著低于0 h（P＜0.05），而枸櫞酸濃度［（2.91±2.31）mmol／L］與0 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 不同條件下保存24 h對(duì)草酸和枸櫞酸濃度的影響

2.4.2 尿液前處理方法的探討 每例標(biāo)本分為4組（A～D），分別按100∶1（即刻，A）、50∶1（即刻，B）、100∶1（24 h后，C）和50∶1（24 h后，D）加入6 mol／L HCl酸化。無(wú)論在無(wú)結(jié)石對(duì)照組還是結(jié)石組，草酸D組測(cè)量結(jié)果與B組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），而A組、C組與B組相比均降低（P均＜0.05）（圖1a），枸櫞酸A、C、D組與B組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（圖1b）。

Bland-Altman分析顯示，草酸B組和D組檢測(cè)結(jié)果有97.5%（39／40）的點(diǎn)在95%一致性界限范圍內(nèi)（圖1c），枸櫞酸B組和D組檢測(cè)結(jié)果有95.0%（38／40）的點(diǎn)在95%一致性界限范圍內(nèi)（圖1d）。因此，在尿液收集即刻和24 h后按50∶1的比例加入6 mol／L HCl兩種處理方法具有較好的一致性。

圖1 標(biāo)本收集前后加入不同比例HCl對(duì)草酸和枸櫞酸濃度的影響

2.4.3 標(biāo)本凍存穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 尿液標(biāo)本在－20℃條件下凍存1、3、7、14、30 d。標(biāo)本解凍后，按50∶1的比例加入6 mol／L HCl酸化，分別檢測(cè)草酸和枸櫞酸，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。與0 d時(shí)相比，檢測(cè)結(jié)果的偏倚均在－10%～10%之間，穩(wěn)定性良好，臨床樣本不能及時(shí)檢測(cè)時(shí)可在－20℃條件保存30 d。

圖2 草酸在－20℃凍存條件下的穩(wěn)定性

圖3 枸櫞酸在－20℃凍存條件下的穩(wěn)定性

3 討論

本研究系統(tǒng)評(píng)價(jià)了兩種酶法檢測(cè)尿液草酸和枸櫞酸的試劑性能，以及分析前尿液標(biāo)本的前處理對(duì)于被測(cè)量的影響。本研究草酸和枸櫞酸試劑盒分別在1.8～180 mg／L和0.2～13 mmol／L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。與協(xié)和醫(yī)院團(tuán)隊(duì)［9-10］建立的LC-MS／MS方法比較，本研究采用的酶法線性范圍更寬。初步在20例對(duì)照者和20例腎結(jié)石的人群中進(jìn)行草酸和枸櫞酸的測(cè)定，草酸的范圍為7.89～41.36 mg／L，枸櫞酸的范圍為0.4～5.7 mmol／L，均在酶法的線性范圍內(nèi)，而部分枸櫞酸濃度則超出了LC-MS／MS法的線性范圍。對(duì)草酸和枸櫞酸的LC-MS／MS法和酶法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行的比對(duì)顯示，二者準(zhǔn)確度相當(dāng)（N＝20，R值分別為0.93和0.97）［9-10］。酶法檢測(cè)草酸和枸櫞酸具有在臨床推廣使用的可靠性能。本團(tuán)隊(duì)基于酶法初步對(duì)77例腎結(jié)石患者的24 h尿液代謝評(píng)估顯示，低枸櫞酸尿?yàn)樽畛Ｒ?jiàn)的代謝異常，占80.5%，33.8%存在高草酸排泄，為尋找病因和制定預(yù)防策略提供了依據(jù)。

檢測(cè)尿液草酸時(shí)，不同的實(shí)驗(yàn)室采用不同的前處理方法，包括過(guò)濾、超速離心等，目的是為了去除可能干擾。我們探討了血紅蛋白和總蛋白對(duì)尿液草酸和枸櫞酸酶法檢測(cè)的干擾。研究發(fā)現(xiàn)，枸櫞酸檢測(cè)方法相對(duì)抗干擾能力較強(qiáng)，而血紅蛋白對(duì)尿液草酸檢測(cè)干擾較大。血紅蛋白濃度超過(guò)2 g／L時(shí)，將顯著低估尿液草酸濃度，可能造成臨床上對(duì)草酸代謝異常的誤診。臨床上結(jié)石患者可能伴隨其他疾病，因此，應(yīng)加強(qiáng)試劑盒抗干擾能力，或者制定合適的前處理方法，來(lái)保證被測(cè)量不受干擾。

國(guó)外指南［4-5］建議高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的尿石癥患者連續(xù)收集兩次24 h尿液標(biāo)本進(jìn)行代謝評(píng)估，而24 h尿液收集和保存對(duì)于草酸和枸櫞酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在不加任何防腐劑的前提下，無(wú)論室溫還是4℃保存，24 h后測(cè)得的草酸濃度均顯著降低。這可能是由于尿液中草酸鹽溶解度低，而酸性溶液不但有利于草酸鹽溶解，還可有效抑制維生素C等草酸前體物質(zhì)向草酸轉(zhuǎn)化［7］。歐洲泌尿外科指南［16］、中國(guó)泌尿外科疾病診斷指南［17］和全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［18］均要求用于草酸和枸櫞酸檢測(cè)的24 h尿液標(biāo)本需用HCl保存。

Braiotta等［19］認(rèn)為按照100∶1的比例加入HCl，無(wú)論在24 h尿液收集前還是收集后，對(duì)于草酸濃度的檢測(cè)沒(méi)有區(qū)別。但是本研究中按100∶1的比例加入6 mol／L HCl，無(wú)論收集即刻還是24 h后酸化，均不能使尿液中草酸鹽完全溶解，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低；按照50∶1的比例加入6 mol／L HCl，無(wú)論在尿液收集即刻還是收集后24 h加入，均可保證草酸濃度穩(wěn)定，與Ferraz等［20］得出的結(jié)論一致。這可能是所用HCl的濃度不同所致。Ferraz等［20］發(fā)現(xiàn)尿液收集24 h后再按50∶1的比例加入6 mol／L HCl酸化測(cè)得的枸櫞酸濃度輕微下降（健康對(duì)照5.9%，結(jié)石樣本3.1%），但小于實(shí)驗(yàn)方法的總變異系數(shù)，不會(huì)影響臨床低枸櫞酸尿癥的診斷。

在臨床實(shí)踐中，尿石癥患者的代謝評(píng)估需要用24 h尿液檢測(cè)一系列項(xiàng)目，如pH、鉀、鈉和氯要直接檢測(cè)，而檢測(cè)尿酸則需堿化尿液。若24 h尿液收集前加入酸，則不能檢測(cè)尿酸等其他項(xiàng)目。本研究發(fā)現(xiàn)，尿液收集24 h后再酸化不影響草酸和枸櫞酸測(cè)量，更具實(shí)用性，保證患者留取一次24 h尿液可檢測(cè)多種代謝標(biāo)志物。

綜上，尿液草酸和枸櫞酸的酶法檢測(cè)試劑盒的性能良好，可以滿足臨床診斷和治療監(jiān)測(cè)需求；收集尿液24 h后按50∶1的比例加入6 mol／L HCl酸化可用于草酸和枸櫞酸的檢測(cè)。建議臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展24 h尿液草酸和枸櫞酸的檢測(cè)，輔助腎結(jié)石的臨床診療、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)防管理，以降低結(jié)石發(fā)生率和復(fù)發(fā)率。