邱方，諸萍，王嬋，江鵬，劉向東（1.南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京10031；.東南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京10096）

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種累及肝內(nèi)膽管系統(tǒng)的慢性進(jìn)行性自身免疫病，實(shí)驗(yàn)室檢查常見(jiàn)血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性持續(xù)異常升高、抗線粒體抗體－M2（anti mitochondrial antibody-M2，AMA-M2）陽(yáng)性，病理學(xué)檢查顯示肝臟內(nèi)非化膿性膽汁淤積和小葉間膽管炎性損傷，只要符合兩點(diǎn)即可確 診［1-2］。熊 去 氧 膽 酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是美國(guó)和歐洲肝病學(xué)會(huì)推薦的PBC治療唯一的一線藥物，能有效改善PBC的自然病史，但有約40%的患者對(duì)UDCA無(wú)藥物生化應(yīng)答［1］。多個(gè)基于生化變量的預(yù)后預(yù)測(cè)量化模型已廣泛應(yīng)用于PBC患者的風(fēng)險(xiǎn)分層管理，其中清蛋白（albumin，Alb）－膽紅素（bilirubin，TBil）評(píng)分（ALBI）是近年來(lái)被用于PBC預(yù)后預(yù)測(cè)的新模型，被證實(shí)與Mayo評(píng)分等主要預(yù)后評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及肝臟組織學(xué)有很好的相關(guān)性［3-4］。

AMA-M2陽(yáng)性率在PBC中可達(dá)90%～95%，其靶抗原是線粒體內(nèi)膜上的2－氧酸脫氫酶復(fù)合體（2-OADC），識(shí)別的抗原表位是2-OADC的主要組分丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2（PDC-E2）、支鏈二酮酸脫氫酶復(fù)合體E2（BCOADC-E2）和2－酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體E2（OGDC-E2）［5］。國(guó)外學(xué)者曾對(duì)PBC患者上述抗原表位分布進(jìn)行分析，但未進(jìn)一步研究不同抗原表位的臨床價(jià)值，國(guó)內(nèi)也未見(jiàn)此類(lèi)報(bào)道。本研究擬分析374例漢族PBC患者PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2 3種AMA-M2抗原表位的分布情況，并探討其臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取江蘇省PBC研究協(xié)作組建立的PBC生物樣本庫(kù)保存的2008年至2014年有完整臨床資料的漢族PBC患者血清標(biāo)本374例（主要來(lái)自蘇州市第五人民醫(yī)院、無(wú)錫市第五人民醫(yī)院、鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院、南京市第二醫(yī)院、東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)、常州第三人民醫(yī)院），其中男63例，女311例，年齡（55.6±11.8）歲。所有納入分析的患者均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）AMA-M2血清學(xué)檢測(cè)呈陽(yáng)性；（2）生化膽汁淤積指標(biāo)（如ALP和TBil）異常升高；（3）各類(lèi)肝炎病毒感染指標(biāo)陰性；（4）無(wú)血吸蟲(chóng)感染史、藥物性肝炎史、酒精性肝炎病史。AMA-M2血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果均經(jīng)東南大學(xué)教育部發(fā)育與疾病相關(guān)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)驗(yàn)證，該方法與商品化AMA-M2 ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較符合率為98.3%［6］。其中，184例PBC患者有跨度在1年以上的多次臨床資料，可用于UDCA藥物生化應(yīng)答情況的分析。

1.2 臨床資料收集 計(jì)算ALBI評(píng)分，公式：ALBI＝0.66×lg［TBil（μmol／L）］－0.085×［Alb（g／L）］。ALBI分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)，ALBI評(píng)分≤－2.60；2級(jí)，－2.60＜ALBI評(píng)分≤－1.39；3級(jí)，ALBI評(píng)分＞－1.39，1、2、3級(jí)PBC預(yù)后不佳的風(fēng)險(xiǎn)依次升高［3］。采用巴黎Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)［2］對(duì)PBC患者進(jìn)行UDCA生化應(yīng)答分類(lèi)，有生化應(yīng)答的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：UDCA治療1年后，ALP≤3×正常上限（upper limit of normal，ULN），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）≤2×ULN，TBil≤17.1μmol／L。

1.3 主要儀器與試劑 96孔酶聯(lián)板（Thermo公司），1575洗板機(jī)、iMark酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），小牛血清（BSA，Sigma公司），辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗人IgG抗體（Millipore公司）。pET28a載體、GB05-Dir大腸埃希菌（東南大學(xué)教育部發(fā)育與疾病相關(guān)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.4 PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重組蛋白的制備 采用Red／ET重組技術(shù)制備PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重組蛋白［6-7］。應(yīng)用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)含Red／ET重組同源臂的引物，引物序列見(jiàn)表1，由南京金斯瑞公司合成。以HepG2細(xì)胞cDNA為模板，用PCR技術(shù)擴(kuò)增PDC-E2 cDNA（1 686 bp）、BCOADC-E2 cDNA（1 260 bp）和OGDC-E2 cDNA（1 161 bp）。采用Red／ET重組技術(shù)將擴(kuò)增的cDNA與pET28a載體共同轉(zhuǎn)入GB05-Dir大腸埃希菌中，送南京金斯瑞公司進(jìn)行Sanger法基因測(cè)序比對(duì)后，將正確的克隆導(dǎo)入大腸埃希菌BL21中大量誘導(dǎo)表達(dá)，獲得N端帶有6-His標(biāo)簽的PDC-E2、BCOADC-E2和C端帶有6-His標(biāo)簽的OGDC-E2重組蛋白。經(jīng)Ni-NTA凝膠純化后，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)鑒定。

表1 各抗原表位蛋白cDNA PCR擴(kuò)增引物

1.5 ELISA方法的建立 分別以PDC-E2（100 ng）、BCOADC-E2（100 ng）和OGDC-E2（300 ng）為靶抗原，4℃過(guò)夜包被酶聯(lián)板，次日使用1575洗板機(jī)，用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗板4次。用1%小牛血清（BSA）封閉酶聯(lián)板反應(yīng)孔，室溫放置2 h后，用PBST洗板4次。待測(cè)樣本用1%BSA按1∶1 000稀釋，取100μL加入反應(yīng)孔，經(jīng)室溫溫育1 h后用PBST洗板5次。用1%BSA按1∶50 000稀釋辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗人IgG抗體，取100μL加入反應(yīng)孔，經(jīng)室溫溫育1 h后用PBST洗板5次，分別加入底物B（過(guò)氧化氫溶液）和底物A（四甲基聯(lián)苯胺溶液）各50μL，室溫放置20 min，加入終止液（H2SO4溶液）50μL，用iMark酶聯(lián)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值（A值）。結(jié)果判定：分別測(cè)定20例AMA-M2陰性的健康人血清，計(jì)算A均值和標(biāo)準(zhǔn)差（s），以A均值＋3s為cut-off值，大于cut-off值判定為有反應(yīng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料中多組數(shù)據(jù)比較采用K-W檢驗(yàn)，兩組間數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；分類(lèi)變量比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重組蛋白的鑒定 SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 SDS-PAGE鑒定純化后3種AMA-M2抗原表位的重組蛋白

2.2 3種AMA-M2抗原表位與PBC患者血清反應(yīng)性的分布情況 ELISA測(cè)定抗 PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重組蛋白的cut-off值分別為0.332、0.359和0.257。374例PBC患者血清與PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2 3個(gè)抗原表位有反應(yīng)性的比例分別為86.6%（324／374）、88.0%（329／374）和35.0%（131／374），有3例與3個(gè)抗原表位均無(wú)反應(yīng)性，但其AMA-M2檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。PBC患者血清對(duì)PDC-E2＋BCOADC-E2＋OGDC-E2、PDC-E2＋BCOADC-E2、PDC-E2、BCOADC-E2、PDC-E2＋OGDC-E2、BCOADC-E2＋OGDC-E2和OGDC-E2有反應(yīng)性的例數(shù)分別為119、164、33、43、8、3和1例，PDC-E2＋BCOADC-E2＋OGDC-E2、PDC-E2＋BCOADC-E2、PDC-E2、BCOADC-E2是PBC患者血清有反應(yīng)性的常見(jiàn)抗原表位反應(yīng)模式，分別以A、B、C和D模式表示。

2.3 常見(jiàn)抗原表位反應(yīng)模式間PBC患者ALBI分級(jí)結(jié)果的比較 根據(jù)ALBI公式計(jì)算PBC患者的評(píng)分結(jié)果，按照分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為ALBI-1、2、3級(jí)。4種常見(jiàn)抗原表位反應(yīng)模式間A模式ALBI-1患者比例低于C和D模式，ALBI-3級(jí)患者比例高于C和D模式，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為14.174和14.167，P均＜0.05）。B模式ALBI-1級(jí)患者的比例低于C和D模式，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為10.350和9.510，P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 常見(jiàn)抗原表位反應(yīng)模式間PBC患者ALBI分級(jí)情況比較［n（%）］

2.4 UDCA生化應(yīng)答和不應(yīng)答患者間3種抗原表位分布比較 采用巴黎Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)對(duì)有治療1年前后生化檢驗(yàn)結(jié)果的184例患者進(jìn)行UDCA藥物生化應(yīng)答分類(lèi)，應(yīng)答和不應(yīng)答患者各有95例和89例，藥物應(yīng)答比例為51.6%。不應(yīng)答患者血清與BCOADC-E2的反應(yīng)率（89.9%）高于不應(yīng)答者（77.9%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。C模式中不應(yīng)答患者的比例高于A、B和D模式，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為5.096、9.403和7.993，P均＜0.05），見(jiàn)表4。

表3 應(yīng)答和不應(yīng)答患者間抗原表位反應(yīng)率比較

表4 常見(jiàn)抗原表位反應(yīng)模式間應(yīng)答和不應(yīng)答患者分布比較［n（%）］

3 討論

上世紀(jì)60年代Walker等發(fā)現(xiàn)PBC患者血清中存在AMA，80年代Gershwin等發(fā)現(xiàn)并成功克隆AMA的抗原表位PDC-E2，90年代進(jìn)一步確認(rèn)BCOADC-E2和OOGDC-E2也是AMA的抗原表位［8］。

歐美學(xué)者采用免疫印跡法檢測(cè)PBC患者血清與PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2的反應(yīng)率分別為81.7%、59.1%和27.4%［9］，與本研究結(jié)果的86.6%、88.0%和35.0%有一定的差異，尤其是BCOADC-E2。本研究采用的BCOADC-E2是全長(zhǎng)片段，Leung等［10］認(rèn)為AMA-M2的結(jié)合能力與BCOADC-E2肽段的長(zhǎng)度呈正相關(guān)，這可能是導(dǎo)致結(jié)果差異的主要原因。PBC患者血清與3個(gè)抗原表位的反應(yīng)模式共有7種，本研究結(jié)果表明漢族PBC患者以PDC-E2＋BCOADC-E2＋OGDC-E2（A模式）、PDC-E2＋BCOADC-E2（B模式）、PDC-E2（C模式）和BCOADC-E2（D模式）4種反應(yīng)模式為主。分析抗原表位與PBC預(yù)后不佳的風(fēng)險(xiǎn)程度的關(guān)系表明，PBC預(yù)后不佳高風(fēng)險(xiǎn)級(jí)的ALBI-3級(jí)患者在A、B、C和D模式中的比例依次降低，其中A與C、D模式的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示不同抗原表位對(duì)PBC預(yù)后的影響存在疊加效應(yīng)，與PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2 3個(gè)抗原表位同時(shí)有反應(yīng)性的PBC患者疾病預(yù)后不佳的風(fēng)險(xiǎn)較高。

本研究采用被美國(guó)肝病學(xué)會(huì)認(rèn)為最簡(jiǎn)單有效的巴黎Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PBC患者UDCA生化應(yīng)答進(jìn)行分類(lèi)［2］，并分析應(yīng)答和不應(yīng)答患者血清與3個(gè)AMA-M2抗原表位和常見(jiàn)抗原表位反應(yīng)模式分布的差異，結(jié)果表明不應(yīng)答患者對(duì)BCOADC-E2的反應(yīng)率明顯高于應(yīng)答組，但應(yīng)答組的陽(yáng)性率也高達(dá)77.9%。本研究結(jié)果還顯示僅與BCOADC-E2有反應(yīng)的UDCA應(yīng)答PBC患者比例是不應(yīng)答患者的2倍，僅與PDC-E2有反應(yīng)的不應(yīng)答患者比例則遠(yuǎn)高于應(yīng)答患者，而與3個(gè)或2個(gè)抗原表位同時(shí)有反應(yīng)性的應(yīng)答和不應(yīng)答患者的比例相差卻不明顯。提示BCOADC-E2和PDC-E2抗原表位可能與UDCA應(yīng)答相關(guān)，但可能存在交互作用。在今后的研究中需要通過(guò)定量方法確定2類(lèi)患者血清與BCOADC-E2和PDC-E2反應(yīng)強(qiáng)度的差異，并跟蹤其反應(yīng)強(qiáng)度及肝功能生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，分析其與UDCA療效的相關(guān)性。