黃 玨，王正亮，潘海波，裘 慧，俞曉平

( 1.中國計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018； 2.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 311215 )

傳統(tǒng)鑒別方法主要基于形態(tài)特征，適用于部分未經(jīng)加工的原始形態(tài)的動(dòng)物性水產(chǎn)品的鑒定。然而，絕大部分動(dòng)物性水產(chǎn)品在銷售前均經(jīng)過一定程度的后加工處理(如切碎、混合、加熱和殺菌等)，從而失去或改變了可識(shí)別的外部形態(tài)特征。此外，這種感官識(shí)別方法對(duì)一些近緣物種的鑒別也存在較大困難，其需要一定的專業(yè)分類知識(shí)，主觀意識(shí)較強(qiáng)，極易混淆出錯(cuò)。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)也取得了長足的進(jìn)步，形成了一系列基于核酸檢測(cè)的鑒偽技術(shù)方法。筆者綜述了常用的幾種基于DNA檢測(cè)的動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)，包括沿用至今的經(jīng)典技術(shù)以及當(dāng)前食品安全認(rèn)證領(lǐng)域內(nèi)的新興技術(shù)，分析這些技術(shù)的原理和特點(diǎn)及其在動(dòng)物性水產(chǎn)品中的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，并分析這些技術(shù)應(yīng)用過程中的優(yōu)勢(shì)和不足，以期為動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽新技術(shù)的開發(fā)提供參考。

1 基于DNA檢測(cè)的動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)

DNA可以作為物種鑒定過程中一類重要的分子標(biāo)記。目前，以DNA檢測(cè)為基礎(chǔ)開發(fā)的動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)主要包括經(jīng)典DNA分子標(biāo)記技術(shù)、種特異性PCR、多重PCR、定量PCR、數(shù)字PCR、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、微流控PCR芯片技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)和高分辨率溶解曲線分析技術(shù)等。

1.1 經(jīng)典DNA分子標(biāo)記技術(shù)

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是一類以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的反映生物體間DNA水平差異的技術(shù)，最初主要應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究，后來逐漸擴(kuò)展到物種真?zhèn)舞b定領(lǐng)域。目前常用的 DNA 分子標(biāo)記技術(shù)包括限制性長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、簡單重復(fù)序列(SSR)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。在動(dòng)物性水產(chǎn)品源性成分鑒定研究中，這些分子標(biāo)記技術(shù)通常與PCR和電泳等技術(shù)聯(lián)用。如Lin等[4]建立了能有效區(qū)分常見8種金槍魚種類的PCR-RFLP方法，并利用所建立的技術(shù)分析了18種中國臺(tái)灣市售金槍魚罐頭中金槍魚的種類，發(fā)現(xiàn)其中4種罐頭金槍魚源成分被錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)。Weder等[5]以Cytb基因(148 bp)為靶基因，利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品中金槍魚和鰹魚種類進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，該方法可有效將金槍魚和鰹魚從其他種類的魚產(chǎn)品中區(qū)分開來。Partis等[6]開發(fā)了一種能夠有效鑒定包括澳洲肺魚(Neoceratodusforsteri)、尼羅河鱸魚(Latesniloticus)在內(nèi)的8種魚類物種真實(shí)性檢測(cè)的PCR-RAPD技術(shù)，可以運(yùn)用于市售相關(guān)魚產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別。Maldini等[7]構(gòu)建了AFLP技術(shù)鑒別海產(chǎn)品的數(shù)據(jù)庫，可對(duì)32種冷凍動(dòng)物性水產(chǎn)品(包括20種魚類、4種甲殼類和8種軟體類)種類進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

經(jīng)典DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡單、試驗(yàn)成本相對(duì)較低、無需復(fù)雜的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在耗時(shí)相對(duì)較長、靈敏度較低、可重復(fù)性較差等缺點(diǎn)，且很難在食品鑒偽中獲得可靠的定量信息。

1.2 種特異性PCR

種特異性PCR(SS-PCR)技術(shù)是根據(jù)物種間基因序列差異設(shè)計(jì)種特異性引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)片段的有無或長度的差異來對(duì)物種進(jìn)行鑒定。該技術(shù)關(guān)鍵在于物種特異性引物的設(shè)計(jì)和篩選。目前這些種特異性引物主要基于一些核基因和線粒體基因序列信息設(shè)計(jì)，如內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因等[8]。該技術(shù)是目前動(dòng)物性水產(chǎn)品種源成分檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛的方法之一[9-15]。如宋春萍等[12]建立了一種基于SS-PCR測(cè)定混合魚糜中鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)成分的快速檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)的鰱魚特異性引物具有很強(qiáng)的物種特異性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)9種魚的混合魚糜中鰱魚成分的定性檢測(cè)，靈敏度為1%。潘海云等[13]基于12S rRNA序列信息開發(fā)了一種對(duì)海鰻(Muraenesoxcinereus)魚糜摻假檢測(cè)的SS-PCR技術(shù)，靈敏度達(dá)0.1%，為鑒別海鰻魚糜是否摻假提供了技術(shù)支撐。Kim等[14]基于COⅠ序列信息設(shè)計(jì)了七帶石斑魚(Epinephelusseptemfasciatus)、褐帶石斑魚(E.bruneus)和赤點(diǎn)石斑魚(E.akaara)的種特異性引物，PCR擴(kuò)增分別得到130、262 bp和344 bp的DNA片段，從而有效區(qū)分這3種親緣關(guān)系較近的石斑魚。尹偉力等[15]以COⅠ基因?yàn)榛A(chǔ)建立了一種SS-PCR技術(shù)，可以對(duì)鱈魚與其他5種非鱈魚進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。

SS-PCR技術(shù)無需酶切或測(cè)序，可直接通過凝膠電泳結(jié)果判定物種來源，具有操作簡單、成本低、速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、所需儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)驗(yàn)室混合樣本的檢測(cè)。然而，該技術(shù)需要預(yù)先知道待檢生物的基因組DNA信息。此外對(duì)于一些近緣物種，其序列相似程度較高，有些物種之間可能存在基因滲透，導(dǎo)致在設(shè)計(jì)種特異性引物上存在一定的困難。

1.3 多重PCR

多重PCR(mPCR)又稱復(fù)合PCR，該技術(shù)以常規(guī)PCR為基礎(chǔ)，即針對(duì)多個(gè)檢測(cè)目標(biāo)分別設(shè)計(jì)特異性引物，并置于同一個(gè)PCR體系中進(jìn)行擴(kuò)增，最后利用凝膠電泳或芯片雜交等技術(shù)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的差異來區(qū)分檢測(cè)目標(biāo)[16]。在食品安全控制領(lǐng)域，mPCR主要用于食品中致病微生物的多目標(biāo)檢測(cè)。近年來，該技術(shù)也逐漸應(yīng)用于畜肉、禽肉、魚肉等肉類食品中動(dòng)物源成分的快速鑒別[17-20]。如Veneza等[18]開發(fā)了一種基于COⅠ基因的高效鑒別鯛魚物種的mPCR技術(shù)，可以特異性對(duì)紫紅笛鯛(Lutjanusargentimaculatus)、巴哈馬笛鯛(L.synagris)和敏尾笛鯛(Ocyuruschrysurus)這3種笛鯛魚種進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。Castigliego等[19]以Cytb基因?yàn)榘袠?biāo)序列，建立了一種可以快捷高效鑒別7種的mPCR體系，并成功用于市售產(chǎn)品的摻假檢測(cè)。Lee等[20]基于16S rRNA序列信息分別設(shè)計(jì)了中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)和斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)的mPCR引物，檢測(cè)結(jié)果表明，所設(shè)引物具有高特異性，可以精準(zhǔn)鑒別這3種對(duì)蝦種類。

mPCR技術(shù)保留了常規(guī)PCR的特異性和靈敏性，又可以同步檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)，具有節(jié)約時(shí)間、降低成本、簡便高效的優(yōu)點(diǎn)，且無需復(fù)雜的儀器設(shè)備，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。然而，mPCR對(duì)引物設(shè)計(jì)要求較高，因多對(duì)引物之間在擴(kuò)增時(shí)存在相互干擾，導(dǎo)致各對(duì)引物擴(kuò)增效率不均，甚至?xí)霈F(xiàn)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，從而造成結(jié)果誤判。因此需要對(duì)擴(kuò)增體系和程序進(jìn)行摸索后確定最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.4 定量PCR

定量PCR(qPCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)強(qiáng)度變化來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度變化，最終通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的一種核酸檢測(cè)技術(shù)。根據(jù)所用熒光化學(xué)材料的不同，qPCR主要分為熒光染料法和熒光探針法兩種。目前常用的熒光染料為SYBR熒光染料(如SYBR GreenⅠ)，該染料單獨(dú)存在時(shí)不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，但非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后能發(fā)射熒光信號(hào)，從而使熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的增加完全同步[21]。常用的核酸探針為TaqMan探針，該探針兩端分別標(biāo)記了一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的外切酶活性可將探針酶切降解，致使兩基團(tuán)分離，熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)即可接收熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物同步變化，達(dá)到實(shí)時(shí)定量的目的。目前這兩種qPCR技術(shù)在動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用[22-27]。如孫曉飛等[24]基于COⅠ基因序列建立了一種大西洋鱈魚(G.morhua)的SYBR Green熒光qPCR定性檢測(cè)方法，靈敏度達(dá)到0.06 ng/μL，可用于市售鱈魚及其制品中大西洋鱈成分真實(shí)性的鑒別。郭云霞等[25]以18S rRNA為靶基因，開發(fā)了一種食品中鯊魚源性成分的SYBR Green熒光qPCR鑒定方法。利用該方法對(duì)20種常見的鯊魚產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有待檢產(chǎn)品中除仿魚翅和鯊魚肝油外均能特異性地檢測(cè)出鯊魚成分，檢測(cè)靈敏度達(dá)0.0001 ng/μL。Chuang等[26]設(shè)計(jì)了4種金槍魚的qPCR特異性引物和TaqMan探針，能夠精準(zhǔn)地鑒別大眼金槍魚(T.obesus)、太平洋藍(lán)鰭金槍魚(T.orientalis)、南方藍(lán)鰭金槍魚(T.maccoyii)和黃鰭金槍魚(T.albacores)。此外，Hird等[27]基于不同靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)了大西洋鮭的TaqMan探針，建立了快速鑒別食品中大西洋鮭源性成分的qPCR技術(shù)。

qPCR技術(shù)減少了擴(kuò)增后電泳的檢測(cè)步驟，檢測(cè)速度較快，且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，其中SYBR Green染料法適用性廣，試驗(yàn)成本較低，但對(duì)引物的要求較為苛刻，易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增而導(dǎo)致假陽性結(jié)果；TaqMan法特異性較強(qiáng)、重復(fù)性較好，但價(jià)格偏高。此外，由于熒光素種類以及檢測(cè)光源的局限性，qPCR技術(shù)在多目標(biāo)高通量檢測(cè)應(yīng)用方面亦存在一定的障礙。

1.5 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR(dPCR)是近年來發(fā)展起來的一種新型核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。該技術(shù)基本原理是將待檢核酸樣本稀釋至單分子水平，并平均分配到獨(dú)立的單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集，最后通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出樣品中核酸的原始濃度[28]。dPCR技術(shù)自從誕生之初，就顯示出了在食品安全檢測(cè)應(yīng)用中的巨大優(yōu)勢(shì)。目前，基于dPCR技術(shù)對(duì)動(dòng)物性水產(chǎn)品中源性成分定性篩查和定量檢測(cè)的研究處于起步階段，僅有少量報(bào)道[29-32]。如Noh等[31]采用液滴dPCR方法測(cè)定了海產(chǎn)品中阿拉斯加狹鱈(G.chalcogrammus)的含量，檢測(cè)結(jié)果表明，該方法具有極高的準(zhǔn)確度和靈敏度。Daga等[32]建立了一種精確鑒定食品中魚源成分的dPCR技術(shù)，該技術(shù)針對(duì)18S rRNA序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，能夠?qū)κ称分写笪餮篦L、大西洋鮭和日本鯖(Scomberjaponicus)成分進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，為檢驗(yàn)食品魚過敏原提供了可靠的檢測(cè)方法。

與qPCR相比，利用dPCR進(jìn)行核酸絕對(duì)定量無需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)極限可達(dá)單拷貝，檢測(cè)結(jié)果不受擴(kuò)增效率的影響，具有更高的靈敏度、特異性和精確度，在痕量核酸樣本檢測(cè)方面具有極大的優(yōu)勢(shì)。目前dPCR技術(shù)在實(shí)際推廣應(yīng)用中存在一定的局限性，如存在試驗(yàn)成本較高、儀器設(shè)備價(jià)格高昂、檢測(cè)通量相對(duì)有限、操作較為繁瑣等問題。

1.6 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(IAT)是一種建立在PCR基礎(chǔ)上的衍生技術(shù)，能夠在恒溫條件下對(duì)特定核酸進(jìn)行快速PCR擴(kuò)增?；诜磻?yīng)原理的不同，目前已發(fā)展出諸多種類的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，包括鏈替代擴(kuò)增(SDA)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)、依賴解旋酶DNA擴(kuò)增(HAD)技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)、信號(hào)介導(dǎo) RNA擴(kuò)增(SMART)技術(shù)和切刻內(nèi)切酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(NEMA)技術(shù)等[33]。其中，LAMP技術(shù)在食品鑒偽領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛[34-35]。該技術(shù)最初于2000年由日本學(xué)者Notomi等[36]發(fā)明，之后又經(jīng)過Nagamine等[37]改進(jìn)，主要是利用4～6條特異性引物對(duì)靶標(biāo)序列6～8個(gè)區(qū)域進(jìn)行識(shí)別，在Bst DNA聚合酶催化作用下，于恒溫60～65 ℃下溫育30～60 min，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的批量擴(kuò)增，最后結(jié)合凝膠電泳技術(shù)或染料可視化手段進(jìn)行結(jié)果判定。張懿翔等[38]利用LAMP技術(shù)對(duì)食品中過敏原牡蠣成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法靈敏度好且特異性高，可以檢測(cè)出含牡蠣成分0.1%，DNA質(zhì)量濃度為0.01 ng/μL的樣品。馮俊麗等[39-40]分別基于線粒體D-loop區(qū)和Cytb基因序列設(shè)計(jì)了大西洋鮭的特異性LAMP引物，并建立了可用于檢測(cè)市售大西洋鮭摻偽的LAMP技術(shù)體系。Wang等[41]基于Cytb基因建立了一種大西洋鱈、大頭鱈(G.macrocephalus)和黑線鱈(Melanogrammusaeglefinus)3種鱈魚魚肉成分的LAMP可視化快速檢測(cè)方法，其絕對(duì)檢測(cè)限分別為285、37、197 pg/μL，相對(duì)檢測(cè)限分別為1%、0.1%和1%，可有效應(yīng)用于市售鱈魚魚肉及其深加工制品的快速檢測(cè)。

與常規(guī)PCR相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是在單一溫度下對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增或信號(hào)放大，具有檢測(cè)靈敏度高和特異性好等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)于儀器設(shè)備要求較低，只需有恒溫加熱裝置即可。擴(kuò)增過程減免了升溫和降溫步驟，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且可視化檢測(cè)效果好，適合現(xiàn)場快速檢測(cè)。然而，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也存在試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求高的缺陷，檢測(cè)效果受多種因素影響，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。如LAMP體系中，引物濃度和比例、反應(yīng)溫度和時(shí)間、dNTPs以及甜菜堿的添加量可顯著影響最終檢測(cè)效果。

1.7 DNA芯片技術(shù)

DNA芯片技術(shù)，也稱DNA微陣列技術(shù)或基因芯片技術(shù)，是通過特殊手段將已知的DNA探針以一定的排列方式固化于固相支持物(如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜或尼龍膜等)表面，然后與標(biāo)記的待測(cè)樣品進(jìn)行分子雜交，通過雜交信號(hào)的有無及強(qiáng)弱來對(duì)靶基因進(jìn)行定性或定量檢測(cè)[42]。憑借其高通量和自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，DNA芯片技術(shù)已在食源微生物、食品摻偽、轉(zhuǎn)基因食品以及食品過敏原檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。目前，基于DNA芯片的動(dòng)物性水產(chǎn)品真?zhèn)舞b別亦有諸多報(bào)道[43]。如Kim等[44]基于COⅠ基因制備了一種DNA芯片，能夠有效鑒別韓國11種淡水魚類。Kappel等[45]基于Cytb和16S rRNA序列信息開發(fā)了一種“魚類芯片”，可有效鑒別包括阿拉斯加狹鱈、大西洋鮭和斑點(diǎn)鈍腹鯡(Clupeaharengus)在內(nèi)的10種魚類。Kochzius等[46]以16S rRNA為目標(biāo)序列設(shè)計(jì)了一種針對(duì)歐盟重要的11種進(jìn)口魚類的DNA芯片，成功應(yīng)用于歐盟重要進(jìn)口魚類的監(jiān)控。

DNA芯片技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)是高通量，能夠大規(guī)模準(zhǔn)確快速地進(jìn)行同步檢測(cè)分析。此外，該技術(shù)所需樣本量少，可用于混合樣本檢測(cè)。然而，DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用也存在一定的局限，如開發(fā)時(shí)間成本較高，檢測(cè)靈敏度較低，需預(yù)先知道樣本的基因序列信息，且特異性探針設(shè)計(jì)要求較高，否則容易出現(xiàn)假陽性或假陰性，引起結(jié)果誤判。

1.8 微流控PCR芯片技術(shù)

微流控PCR芯片技術(shù)是近年來一種以微流控技術(shù)為核心發(fā)展起來的新興核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)通過微加工手段，在玻璃、單晶硅或有機(jī)聚合物等固相支持物表面進(jìn)行功能化分區(qū)(如流體微通道、反應(yīng)微腔室和儲(chǔ)液池等)，將樣品分析過程中的核酸提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物分離和檢測(cè)等基本操作單元集成于一塊微米尺度的芯片上，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程的全自動(dòng)化[47]。根據(jù)芯片的結(jié)構(gòu)差異，微流控PCR芯片可分為反應(yīng)池內(nèi)固定擴(kuò)增式PCR芯片和連續(xù)流動(dòng)式PCR芯片兩種[48]。前者是常規(guī)PCR的微型化，反應(yīng)體系不流動(dòng)，通過芯片整體升溫降溫的循環(huán)來實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。后者PCR反應(yīng)體系沿著芯片微通道中3個(gè)恒溫區(qū)(高溫—低溫—中溫)連續(xù)流動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)DNA的變性、退火和擴(kuò)增。微流控PCR芯片技術(shù)最初主要應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，目前亦向食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域逐漸擴(kuò)展，但在食品摻偽鑒別，特別是針對(duì)水產(chǎn)品中動(dòng)物源性成分的快速鑒定應(yīng)用中尚處早期研究階段。如虞惠貞等[49]設(shè)計(jì)研制了一套用于包括7種魚類在內(nèi)的24種動(dòng)物源性成分快速檢測(cè)的TaqMan微流控PCR芯片系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)多物種高通量同步檢測(cè)，并經(jīng)驗(yàn)證表明所建立的技術(shù)在重復(fù)性、特異性和靈敏度方面都能滿足物種成分真?zhèn)舞b定的需求。

微流控PCR芯片技術(shù)具有集成化、小型化和自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，以及樣品需求量小、試劑消耗量少、污染小、檢測(cè)速度快和高通量等諸多優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)結(jié)果出”的現(xiàn)場快速檢測(cè)。目前微流控PCR芯片仍處于研發(fā)階段，技術(shù)不夠成熟，開發(fā)周期較長，且產(chǎn)品缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，一定程度限制了微流控PCR芯片的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1.9 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼的概念由加拿大科學(xué)家Hebert等[50]于2003年首次提出，即通過一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的短基因片段(即DNA條形碼)的序列變異來鑒定物種。該技術(shù)的關(guān)鍵在于找到適合特定生物類群的理想DNA條形碼。一般理想的DNA條形碼需符合以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有特定類群的物種識(shí)別能力，即具有一定的種內(nèi)保守性和種間的變異性；(2)具有高度保守的引物設(shè)計(jì)區(qū)以便于設(shè)計(jì)通用引物；(3)要求片段長度適中，便于擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)分析。大量研究表明，線粒體COⅠ基因的N端658 bp片段可作為動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼[51]。此外，DNA條形碼技術(shù)高效應(yīng)用在很大程度上還取決于DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的完備程度。國際上第一個(gè)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫——生命條形碼數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)(BOLD systems)由國際生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)于2007年建立。該系統(tǒng)內(nèi)包含針對(duì)全球魚類的條形碼數(shù)據(jù)庫 Fish-BOL(Fish Barcode of Life，http:∥fishbol.org/)，迄今已覆蓋超過34 000種魚類物種[52]。國內(nèi)亦構(gòu)建了中國漁業(yè)生物DNA條形碼信息平臺(tái)(http:∥www.fishery-barcode.cn)，涵蓋6000余種漁業(yè)生物的憑證信息和DNA條形碼資源，為我國水產(chǎn)品物種鑒定提供了重要數(shù)據(jù)資源[53]。目前DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中動(dòng)物源成分的真?zhèn)舞b別[54-58]。胡冉冉等[54]以COⅠ基因和16S rRNA基因作為靶基因?qū)鴥?nèi)市售的24種海參進(jìn)行鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6份樣品與標(biāo)簽名稱不符，存在將低價(jià)海參品種標(biāo)為高價(jià)海參的現(xiàn)象。石蕊寒等[55]亦證明COⅠ基因和16S rRNA基因在魚類物種鑒別中具有很高的準(zhǔn)確性，可用于市售魚肉及其深加工制品的真?zhèn)舞b別。Pappalardo等[56]運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)意大利南部市場中零售的歐洲鰈(Pleuronectesplatesa)和歐洲鰨(Soleasolea)魚片樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，35%的歐洲鰈和41%的歐洲鰨樣本有錯(cuò)貼標(biāo)簽現(xiàn)象。此外，Shokralla等[57]建立了一種針對(duì)魚產(chǎn)品鑒偽的mini-barcoding技術(shù)體系，利用較短長度的DNA條形碼序列即可有效對(duì)北美市場中主要的商業(yè)化深加工魚肉制品進(jìn)行物種鑒定。

DNA條形碼技術(shù)是一種簡單、快速、有效物種鑒別方法，不受生物發(fā)育階段影響，可有效鑒定殘缺個(gè)體和近緣物種，操作者無需掌握豐富的專業(yè)知識(shí)。在DNA條形碼數(shù)據(jù)庫存在的前提下，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)可以一次性快速鑒定大量樣本。然而，該技術(shù)也存在一些缺陷，如深加工制品中DNA的嚴(yán)重降解會(huì)影響DNA條形碼的擴(kuò)增效率；結(jié)果分析需要完善的數(shù)據(jù)庫資源作為支撐；此外，核內(nèi)假基因和近緣物種間基因交流也會(huì)導(dǎo)致依據(jù)DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤。

1.10 高分辨率熔解曲線分析技術(shù)

高分辨率熔解曲線分析(HRM)技術(shù)是近年來興起的一種PCR擴(kuò)增后檢測(cè)技術(shù)，可高通量檢測(cè)基因突變，主要用于基因分型和單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)等研究。該技術(shù)基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入新型DNA熒光染料，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物在熔鏈過程中熒光信號(hào)的變化來繪制熔解曲線，最后通過熔解曲線形狀的差異來判斷DNA分子堿基組成差異，從而達(dá)到區(qū)分物種的目的[59]。目前，該技術(shù)在動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽應(yīng)用研究中已有諸多成功事例[60-64]。如Fitzcharles等[61]基于COⅠ基因序列開發(fā)了一種可以有效區(qū)分形態(tài)相似的4種南極魚的高分辨率熔解曲線方法，具有快速、穩(wěn)定和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。Fernandes[62]同樣以COⅠ基因?yàn)榘袠?biāo)，建立了一種快速檢測(cè)鑒定5種商業(yè)對(duì)蝦的高分辨率熔解曲線技術(shù)體系，能有效區(qū)分凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、印度明對(duì)蝦(F.indicus)、近緣新對(duì)蝦(Metapenaeusaffinis)和緣溝對(duì)蝦(Alohaprawn)，鑒定精度超過99%。該團(tuán)隊(duì)同樣利用高分辨率熔解曲線方法，以Cytb基因?yàn)榘袠?biāo)開發(fā)了一種鑒別大西洋鱈、大頭鱈、阿拉斯加狹鱈等鱈魚的技術(shù)，并利用該技術(shù)對(duì)30份市售標(biāo)簽為鱈魚的魚肉樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30%的樣本被錯(cuò)貼標(biāo)簽，存在以低值魚種代替高值鱈魚出售的現(xiàn)象[63]。

高分辨率熔解曲線技術(shù)無需設(shè)計(jì)特異性探針，可實(shí)現(xiàn)閉管操作，避免樣品交叉污染，具有簡單快速、高通量、高靈敏度、高特異性和高穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，且試驗(yàn)成本遠(yuǎn)低于測(cè)序和qPCR等方法。但高分辨率熔解曲線技術(shù)仍存在一定局限性，如不能用于RNA分子的檢測(cè)、對(duì)部分堿基顛換(A/T或G/C之間突變)鑒別能力較弱、僅限于檢測(cè)短片段擴(kuò)增產(chǎn)物，且對(duì)于熔解曲線相似的堿基變異無法區(qū)分。

2 動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)中常用的DNA靶標(biāo)

以DNA檢測(cè)為基礎(chǔ)的動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)是通過分析樣品中DNA的多態(tài)性來對(duì)樣品中的動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒別，其關(guān)鍵在于選擇合適的DNA靶標(biāo)。目前常用的DNA靶標(biāo)主要來源于線粒體DNA和核DNA。線粒體DNA一般為母系遺傳，具有結(jié)構(gòu)簡單、無內(nèi)含子、無重組和進(jìn)化速度適中等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)中使用最為普遍，如12S rRNA、16S rRNA、COⅠ和Cytb序列已作為分子標(biāo)記廣泛用于FINS、SS-PCR、mPCR、qPCR、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、DNA條形碼和高分辨率熔解曲線技術(shù)等的開發(fā)[13,41]。其中COⅠ基因5′端約650 bp片段被公認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼而廣泛應(yīng)用于不同階元的動(dòng)物種類的鑒定[54]。此外，線粒體基因拷貝數(shù)高，易于提取，在深加工動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽中更具優(yōu)勢(shì)。然而，由于線粒體DNA在組織和個(gè)體間存在拷貝數(shù)差異，基于線粒體DNA的檢測(cè)方法難以在動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽時(shí)對(duì)其中的種源成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量。核DNA，如核糖體18S rRNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS基因等，亦廣泛應(yīng)用于動(dòng)物性水產(chǎn)品中種源成分鑒別技術(shù)的開發(fā)，如RAPD、AFLP和RFLP等技術(shù)[25]。相比于線粒體DNA，核DNA的拷貝數(shù)較低，甚至是單拷貝。因此，基于核DNA開發(fā)的鑒偽技術(shù)在最低檢出限指標(biāo)的比較上往往會(huì)遜于基于線粒體DNA建立的鑒別方法。然而，憑借DNA新檢測(cè)技術(shù)(如等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和dPCR)高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，線粒體DNA因拷貝數(shù)高而呈現(xiàn)的靈敏度優(yōu)勢(shì)正在逐步消失?？梢灶A(yù)見，一些拷貝數(shù)恒定或單拷貝的核DNA會(huì)被更多地選作DNA靶標(biāo)而應(yīng)用于動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽中的定性和定量分析。

3 結(jié)語和展望

隨著人民生活水平的提高，一些高值動(dòng)物性水產(chǎn)品已成為人們餐桌上的常見菜品。保證水產(chǎn)品中動(dòng)物源成分的真實(shí)性日益受到人們的重視。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)也呈現(xiàn)多元化發(fā)展，形成了基于形態(tài)特征的傳統(tǒng)鑒別技術(shù)、仿生感官評(píng)價(jià)技術(shù)、光譜和色譜鑒別技術(shù)以及基于核酸和蛋白質(zhì)的鑒別技術(shù)[65]。其中，基于核酸的分子檢測(cè)是目前食品鑒偽中較具權(quán)威的方法，也是未來發(fā)展的核心趨勢(shì)。DNA是生物體的主要遺傳物質(zhì)，具有物種唯一性和高穩(wěn)定性，極適用于食品安全檢測(cè)監(jiān)測(cè)中種源成分的鑒別。

上述各種以DNA檢測(cè)為基礎(chǔ)的鑒偽技術(shù)均可應(yīng)用于水產(chǎn)品中動(dòng)物源成分的鑒定。但這些技術(shù)的適用范圍、復(fù)雜性和操作成本各有差異(表1)。因此，在實(shí)際應(yīng)用過程中需充分考慮這些因素的綜合影響，要根據(jù)研究的目的、分析的樣本種類和可用的資金，綜合各技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)來選擇不同的檢測(cè)方法。如只是常規(guī)分析少量物種的不同樣本，PCR-RFLP、SS-PCR或mPCR是比較經(jīng)濟(jì)和高效的鑒別方法；但如果需要高通量檢測(cè)不同物種的混合樣本，則DNA芯片技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)或高分辨率熔解曲線技術(shù)更具優(yōu)勢(shì)；對(duì)于一些深加工動(dòng)物性水產(chǎn)品，由于DNA質(zhì)量受損，因此不適于用PCR-RAPD或PCR-AFLP方法，而需采用一些對(duì)DNA質(zhì)量要求相對(duì)較低且靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)，如qPCR、dPCR或mini-barcoding技術(shù)；等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有高靈敏度、檢測(cè)速度快和可視化效果好等優(yōu)點(diǎn)，其在開發(fā)現(xiàn)場快速檢測(cè)技術(shù)方面則具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表1 基于DNA檢測(cè)的10種動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)比較分析

發(fā)揮各種檢測(cè)技術(shù)之間的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)或與新興技術(shù)結(jié)合將成為未來發(fā)展的重要方向。如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控檢測(cè)技術(shù)整合了等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和微流控PCR芯片技術(shù)各自的優(yōu)勢(shì)，具有操作簡便、耗樣量少、特異性強(qiáng)和敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，適于市場食品安全監(jiān)管過程中的即時(shí)檢測(cè)[33]；數(shù)字化等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(dLAMP)則是近年來發(fā)展起來的一種綜合了dPCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的生物檢測(cè)技術(shù)，目前已運(yùn)用于一些食源微生物的快速定量檢測(cè)中[66]；Bar-HRM分析是將高分辨率熔解曲線和DNA條形碼技術(shù)聯(lián)用，具有高靈敏度和高特異性的突出優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[64]。下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)是近年來發(fā)展迅猛的全新DNA測(cè)序技術(shù)，具有通量高、總成本低和信息量高等優(yōu)點(diǎn)[67]。DNA條形碼技術(shù)和dPCR平臺(tái)均可與NGS技術(shù)對(duì)接，在保證高特異性和高靈敏度的前提下，兩者結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)大量樣本的高通量檢測(cè)，從而顯著提高檢測(cè)工作效率[68-69]。如Liu等[68]開發(fā)了一套基于Illumina的COⅠ條形碼全長序列高通量測(cè)序平臺(tái)，其測(cè)序準(zhǔn)確性可與第一代測(cè)序Sanger技術(shù)媲美，且平臺(tái)對(duì)樣品DNA質(zhì)量要求較低，適用于混合樣本的高通量鑒定。近年來，納米技術(shù)和生物傳感器技術(shù)因其快速、高效、直觀、無干擾等優(yōu)點(diǎn)也逐步應(yīng)用于食品安全控制領(lǐng)域[47]。整合這些新興技術(shù)以提高鑒偽效力將是未來基于DNA檢測(cè)的水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)發(fā)展的重要趨勢(shì)之一。

總體上，我國與美國、歐盟等發(fā)達(dá)國家相比，在動(dòng)物性水產(chǎn)品鑒偽技術(shù)開發(fā)研究上起步較晚但發(fā)展很快，總體和國際水平處于跟跑和并跑狀態(tài)。然而，國內(nèi)因研究單位不同，各種技術(shù)在開發(fā)和應(yīng)用過程中沒有形成統(tǒng)一和規(guī)范的操作標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)程，難以形成共享的鑒偽數(shù)據(jù)信息系統(tǒng)，從而限制了相應(yīng)技術(shù)和方法的推廣應(yīng)用。因此，如何實(shí)現(xiàn)這些鑒偽技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化也將是今后的一個(gè)重點(diǎn)研究方向。