賴曉健，彭 帥，張 哲，李忠琴

( 1.集美大學 水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021； 2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021； 3.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361000 )

鰻鱺(Anguillajaponica)為生殖洄游性魚類,在降海洄游過程中性腺逐步發(fā)育成熟，并在大海中完成排卵、受精和胚胎發(fā)育。實驗室條件下，人工養(yǎng)殖或下海的親鰻需要人工誘導性腺才能發(fā)育成熟。應用外源激素對鰻鱺性腺進行人工誘導，結(jié)果表明，雌魚的性腺較雄魚更難誘導成熟，所需的外源激素劑量和誘導時間更長[1]。因此，現(xiàn)有的研究針對雌性鰻鱺較多，而涉及雄性鰻鱺的較少[1]。然而在鰻鱺的人工繁育中，雌、雄鰻鱺性腺發(fā)育的同步性也是重要的影響因素。

目前，人工誘導鰻鱺性腺發(fā)育成熟的主要方法是注射鯉魚(Cyprinuscarpio)或鮭魚垂體勻漿液和人絨毛膜促性腺激素(HCG)混合液[2]。也有學者應用埋植或注射雄激素的方法誘導鰻鱺性腺發(fā)育和成熟[1-3]。其中埋植甲基睪酮(MT)6次后(90 d)，雄魚性成熟比達88.89%；但是埋植需要每15 d操作1次[3]。為減少對親魚的機械損傷，筆者通過改變給藥方式，在養(yǎng)殖水體中加入甲基睪酮，探索其對鰻鱺雄魚性腺發(fā)育的影響，并為改進鰻鱺雄魚的人工催熟技術(shù)提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由于鰻鱺的年齡、生長環(huán)境和激素處理的方法和時長不同，導致性腺發(fā)育的程度各不相同。西太平洋沿岸不同地區(qū)鰻鱺親魚的平均下海年齡為(5.2±0.8)～(8.3±1.6)齡[4]，所以試驗采用本實驗室飼養(yǎng)的7齡鰻鱺雄魚。

鰻鱺親魚取自集美大學水產(chǎn)學院海水試驗場，全長(61.00±1.00) cm，體質(zhì)量(266.45±18.65) g。

1.2 試驗設計

60尾親魚隨機分為對照組和試驗組，采用直徑1.5 m、高1.0 m的圓形養(yǎng)殖桶為試驗容器，水量1000 L，水體為鹽度35的海水。甲基睪酮標準品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司(MB1943-S)，稱取50 mg甲基睪酮先溶解于5 mL無水乙醇，再加入養(yǎng)殖水體中，使試驗組甲基睪酮最終質(zhì)量濃度為50 μg/L，對照組加入5 mL無水乙醇。對照組和試驗組各設2個平行組，每桶10尾親魚。試驗時間為45 d，其間不投喂，對照組和試驗組每5 d換水1/2，同時補充相應的甲基睪酮或無水乙醇，試驗期間控制水溫(21±1) ℃。試驗結(jié)束，對照組和試驗組各隨機采樣5尾。

1.3 生物學數(shù)據(jù)和組織切片

麻醉試驗魚，測量體質(zhì)量和全長。用注射器尾靜脈取血。解剖取性腺及肝臟，稱量質(zhì)量，并計算性腺指數(shù)(wGSI，%)和肝體比(wHSI，%)：

wGSI=m1/m×100%

wHSI=m2/m×100%

式中，m為體質(zhì)量，m1為性腺質(zhì)量，m2為肝臟質(zhì)量。

取部分性腺組織用新配置的4%多聚甲醛固定8～12 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)切片5 μm，蘇木精—伊紅染色，Leica DM5500B顯微鏡觀察和拍照。

1.4 ELISA法測定血清中雌二醇和11-酮基睪酮的質(zhì)量濃度

取全血標本室溫放置2 h或4 ℃過夜后于3068 r/min(離心半徑9.5 cm)離心15 min，取上清液置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)Estradiol ELISA試劑盒和11-Keto Testosterone EIA試劑盒(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, USA)說明書的操作方法檢測血清中雌二醇和11-酮基睪酮的質(zhì)量濃度。對照組和試驗組間的差異用t檢驗進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 鰻鱺精巢的發(fā)育情況

試驗結(jié)束后，輕壓試驗組魚腹部，尚不能擠出精液。測得試驗組性腺指數(shù)為(1.63±0.68)%，顯著高于對照組(P<0.05)，約為對照組的8倍。試驗組肝體比為(1.49±0.10)%，極顯著高于對照組(P<0.01)(表1)。

表1 甲基睪酮暴露對鰻鱺精巢發(fā)育的影響 %

剪開魚腹部，可見對照組精巢處于Ⅱ期，整體為紅色細帶狀，布滿血管，邊緣為鋸齒狀(圖1a)。試驗組精巢處于Ⅳ期，為乳白色的片狀(圖1b)。組織切片可觀察到對照組精小囊處于精子發(fā)生的精原細胞增殖期(S1期)，生殖細胞多為精原細胞，細胞呈圓形，核噬堿性；精巢出現(xiàn)少量精母細胞，其細胞核染色更深(圖2a)。試驗組精巢的精小囊發(fā)育變大，處于精子發(fā)生的精子形成期(S5期)。精母細胞分布在精小囊壁上，精小囊中充滿精細胞，并已出現(xiàn)游離的精子(圖2b)。

圖1 鰻鱺精巢組織Fig.1 Testis of Japanese eel A. japonicaa.對照組精巢； b.試驗組精巢； 箭頭所示為精巢.a.testis in the control group; b.testis in Japanese eel exposed to MT group; arrows show the testis.

圖2 鰻鱺精巢組織切片F(xiàn)ig.2 Photomicrographs of histological sections of testis in Japanese eel A. japonicaa.對照組精巢組織； b.試驗組精巢組織； SPG.精原細胞； SPC.精母細胞； SPD.精子細胞； SPZ.精子.a.testis in the control group; b.testis in Japanese eel exposed to MT group; SPG.spermatogonia; SPC.spermatocyte; SPD.spermatid; SPZ.spermatozoon.

2.2 血清中雌二醇和11-酮基睪酮的質(zhì)量濃度

試驗組鰻鱺血清中雌二醇質(zhì)量濃度為(182.06±30.52) pg/mL，顯著高于對照組的質(zhì)量濃度(3.69±0.72) pg/mL (P<0.05)；11-酮基睪酮質(zhì)量濃度為(7.30±2.15) pg/mL，與對照組的質(zhì)量濃度(5.67±0.37) pg/mL相比無顯著差異(圖3)。

圖3 鰻鱺血清11-酮基睪酮和雌二醇質(zhì)量濃度Fig.3 Serum 11-KT and E2 levels in Japanese eel A. japonica相同上標字母表示無顯著性差異(P>0.05)，不同上標字母表示有顯著性差異(P<0.05).Means with the same letter are not significant differences (P>0.05), and means with different letters are significant differences (P<0.05).

3 討 論

鰻鱺的人工繁育技術(shù)是世界性的難題，我國自20世紀70年代開始開展鰻鱺的人工繁殖技術(shù)研究，通過外源激素誘導得到性腺發(fā)育成熟的親鰻，并得到受精卵和初孵仔魚，但目前仔魚很難度過開口期，存活時間大多僅7～20 d。日本自20世紀60年代開始相關(guān)研究，2010年在實驗室獲得子二代的初孵仔魚[5]。但是由于鰻苗產(chǎn)量低和高昂的柳葉鰻培育成本，目前還不能大批量培育白仔鰻苗，無法達到鰻鱺商業(yè)化養(yǎng)殖的要求，因此相關(guān)的技術(shù)需要進一步研究，如親魚人工催熟催產(chǎn)技術(shù)的優(yōu)化，卵子質(zhì)量的提高，柳葉鰻的培育技術(shù)及其理化條件的優(yōu)化，柳葉鰻期的縮短等[6]。相對雌鰻，雄鰻的人工催熟和催產(chǎn)技術(shù)較為簡易，但仍需重復多次注射操作，因此容易造成機械傷害從而降低精子的質(zhì)量。

3.1 甲基睪酮暴露促進鰻鱺精巢發(fā)育

本試驗結(jié)果顯示，甲基睪酮暴露45 d促進了鰻鱺雄魚的精巢發(fā)育，精巢從Ⅱ期發(fā)育至Ⅳ期，此時精巢以精細胞為主，與長鰭裸頰鯛(Lethrinuserythropterus)和長臀(Cranoglanisbouderius)的Ⅳ期精巢相似[7-8]。精小囊從精原細胞增殖期發(fā)育至精子形成期，已出現(xiàn)游離的精子。方瓊珊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，鰻鱺雄魚按鯉魚垂體0.2 mg/尾+人絨毛膜促性腺激素25 IU/尾誘導35 d后，精小葉中有大量初級精母細胞和次級精母細胞、少數(shù)精子細胞以及管腔中存在少量精子；張潔明等[10]采用鯉魚腦垂體0.5 mg/kg+人絨毛膜促性腺激素50 IU/kg注射催熟鰻鱺雄魚，在注射7針后，63.2%的雄魚可發(fā)育至精子出現(xiàn)期。上述研究中雄魚的精巢發(fā)育期與本試驗中試驗組雄魚近似。鰻鱺雄魚腹腔埋植甲基睪酮(50 μg/g)3次(45 d)后，雄魚成熟率達到41.67%[3]。魚體內(nèi)埋植的甲基睪酮作用更為迅速和直接，因而誘導效果優(yōu)于本試驗，但本試驗的操作簡便，也易于生產(chǎn)應用。歐洲鰻鱺(A.anguilla)雄魚的相關(guān)研究顯示，經(jīng)腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(1.5 IU/g)4周后，性腺指數(shù)即出現(xiàn)顯著升高，約為4%，高于本試驗結(jié)果，但此時精巢發(fā)育大多處于Ⅳ期[11]。人絨毛膜促性腺激素的生理作用與促黃體生成素(LH)近似，與促黃體生成素在性腺細胞中共享一個共同的受體LHR，人絨毛膜促性腺激素通過與精巢中Sertoli細胞和Leydig細胞膜上的LHR受體特異性的結(jié)合[9]，刺激精巢合成和分泌睪酮從而間接起到促進精子發(fā)生的作用[12]，而甲基睪酮可直接作用于性腺，促進精子發(fā)生[13]，效果更為直接。

3.2 甲基睪酮暴露對鰻鱺血清11-酮基睪酮和雌二醇水平的影響

魚類精子的發(fā)生過程需要內(nèi)分泌激素的調(diào)控才能完成，體外試驗證明雄激素的氧化物11-酮基睪酮在鰻鱺精子發(fā)生的整個過程均起到推動作用[14]。但本試驗結(jié)果顯示，經(jīng)甲基睪酮暴露45 d后，雄魚血清11-酮基睪酮質(zhì)量濃度較對照組未顯著升高。已有的研究表明，11-酮基睪酮在精原細胞的增殖過程起主要作用[12,14-17]，但對減數(shù)分裂過程作用不明顯。本試驗中，試驗組精子發(fā)生處于精子形成期，屬于精子發(fā)生的晚期，此時11-酮基睪酮的含量與對照組相比無顯著升高，推測此時11-酮基睪酮的作用不明顯，甲基睪酮轉(zhuǎn)化為11-酮基睪酮的效率很低。同樣，在歐洲鰻鱺雄魚中，雖然人絨毛膜促性腺激素注射3周后，血清11-酮基睪酮含量達到峰值，但是隨后逐漸下降，在人絨毛膜促性腺激素注射7周后(精巢處于Ⅴ～Ⅵ期)，與注射前含量相比無顯著差異[11]。其他魚類的研究也顯示，雄魚開始排精后，血清11-酮基睪酮含量下降，如北極紅點鮭(Salvelinusalpinus)[18]和遠東哲羅鮭(Huchoperryi)[19]。

試驗組雌二醇質(zhì)量濃度顯著高于對照組，推測是部分甲基睪酮通過芳香化酶的作用轉(zhuǎn)化成雌二醇。相似的研究發(fā)現(xiàn)，赤點石斑魚(Epinephelusakaara)埋植甲基睪酮8周后，性腺芳香化酶活性和血清雌二醇質(zhì)量濃度同步升高[20]。以往的研究顯示，雌二醇雖然是一種雌激素，但是在雄魚精子發(fā)生過程中也是不可或缺的。體內(nèi)和體外試驗均表明，10 pg/mL以上質(zhì)量濃度的雌二醇就能夠促進鰻鱺精原干細胞的更新[2]。在青鳉(Oryziaslatipes)[21]的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度(0.01 nmol/L和1 nmol/L)的17α-乙炔雌二醇能刺激體外培養(yǎng)的精巢中精原干細胞的增殖，高濃度的雌二醇(100 nmol/L)反而起抑制作用。本試驗中，試驗組的血清雌二醇質(zhì)量濃度為(182.06±30.52) pg/mL[(0.67±0.11) nmol/L]，此質(zhì)量濃度的雌二醇可促進精子發(fā)生。雌二醇的作用機理是通過升高視黃醇結(jié)合蛋白Ⅰ、Ⅱ基因的表達以調(diào)控視黃酸的合成，從而調(diào)控未分化的精原細胞增殖和分化[22]。

甲基睪酮埋植的鰻鱺雄魚腦部和垂體促性腺激素釋放激素GnRH含量也顯著高于對照組[3]。推測甲基睪酮暴露也可能對下丘腦—垂體軸產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)作用，促進下丘腦促性腺激素釋放激素的合成和分泌，進而促進精巢的發(fā)育和成熟。在歐洲鰻鱺中，經(jīng)人絨毛膜促性腺激素注射3周后，雄魚中腦和間腦的mGnRH表達量達到峰值，Pearanda等[11,23]推測11-酮基睪酮同樣通過正反饋調(diào)節(jié)作用提高GnRH的表達量。

4 結(jié) 論

本試驗采用甲基睪酮浸泡的方法，在已有研究的基礎上改變外源激素的種類和給藥方式，減少人工操作帶來的機械損傷，通過較長時間的微量甲基睪酮的暴露，試驗組魚精巢發(fā)育至Ⅳ期，精子發(fā)生至精子形成期，已出現(xiàn)游離的精子，說明甲基睪酮能夠極大地促進精巢的發(fā)育。如果后期通過注射人絨毛膜促性腺激素和鯉魚垂體再進行催熟，所需的劑量和針數(shù)相比對照組雄魚可大幅減少。下一步的研究可通過優(yōu)化組合不同的激素及其劑量，以進一步促進精巢發(fā)育，提高成熟度。