郭順萍 ，張亞麗 ，尚學(xué)峰 ，李 杰 ，黃曉宇 ，2*，楊巧麗 ，2，滾雙寶 ，2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070）

我國一直以來都是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)業(yè)資源豐富，品種齊全，為我國農(nóng)業(yè)發(fā)展提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。近年來，學(xué)者們關(guān)注到花椒籽作為農(nóng)作物花椒的副產(chǎn)物之一具有很高的利用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，花椒籽可應(yīng)用于營養(yǎng)保健品、生物柴油、緩蝕劑、涂料[1]、花椒籽黑色素、保鮮劑、抗菌肽、膳食纖維以及動物飼料[2]等領(lǐng)域。馬養(yǎng)民等[3]通過對花椒籽油脂肪酸組分分析，發(fā)現(xiàn)花椒籽不飽和脂肪酸高達(dá)78.4%，其中必需脂肪酸亞油酸和α–亞麻酸占47.56%。姚林杰等[4]試驗(yàn)分析得出，花椒籽中蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸的含量較高，營養(yǎng)價(jià)值豐富，作為飼料加入到動物飼糧中，不僅可以達(dá)到補(bǔ)充能量和節(jié)約蛋白的目的，還可以節(jié)約飼料成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，所以花椒籽的開發(fā)研究對養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。

目前，花椒籽在家禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖和育肥豬養(yǎng)殖等方面都有涉及，但都是初步研究，沒有廣泛應(yīng)用。侯玉潔等[5]研究認(rèn)為花椒籽對家禽生長發(fā)育有促進(jìn)作用，能顯著提高家禽的生產(chǎn)性能、增強(qiáng)免疫力、改善胴體品質(zhì)、降低飼料成本，顯著提高經(jīng)濟(jì)效益。付興周等[6]研究表明，用花椒籽粉飼喂肉雞，可顯著提高肉雞的平均日增重，降低料重比，顯著提高肉雞的生長性能，花椒籽粉的芳香、辛麻特性可刺激肉雞的食欲，提高其機(jī)體免疫力，加速肉雞生長。楊克[7]研究發(fā)現(xiàn)，在鯉魚飼料中添加7.5%的花椒籽粉時(shí)會大大降低其生長性能，而添加5%的花椒籽粉會降低飼料成本，且對鯉魚的生長性能沒有負(fù)面影響；梁永飛等[8]試驗(yàn)研究了在基礎(chǔ)飼糧中添加不同比例的花椒籽代替玉米對生長育肥豬的生長性能、肉品質(zhì)和背最長肌的影響，結(jié)果表明，5%花椒籽替代玉米不僅可以提高育肥豬的生長性能，還能顯著改善背最長肌的脂肪酸組成，改善豬肉品質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)通過HE染色方法測量了添加5%花椒籽替代玉米對生長育肥豬的小腸組織（十二指腸、空腸、回腸）的絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度和腸壁厚度的影響，并分析了小腸組織形態(tài)的變化，探究5%花椒籽替代玉米對生長育肥豬小腸組織（回腸、空腸、十二指腸）形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

選擇90日齡、體重33 kg的健康杜×（長h大）三元雜交豬144頭，隨機(jī)分成2組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18頭試驗(yàn)豬只。預(yù)試期7 d后，正試期100 d。試驗(yàn)豬正常飲水和飲食。試驗(yàn)在臨夏州眾惠豬業(yè)科技有限公司進(jìn)行[8]。試驗(yàn)以飼喂5%花椒籽替代基礎(chǔ)飼糧中玉米作為試驗(yàn)組，飼喂基礎(chǔ)飼糧作為對照組，100 d時(shí)采集對照組與試驗(yàn)組的小腸組織樣品進(jìn)行對比分析。

1.1.2 試劑耗材

1.1.3 試驗(yàn)器材

載玻片、蓋玻片、切片盒、組織包埋盒、刀片、高效切片石蠟、轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)、JT-12S自動組織脫水機(jī)、BMJ-A型包埋機(jī)、RS36型全自動染色機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀、數(shù)字切片掃描儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本采集

試驗(yàn)結(jié)束后，分別采集對照組和添加5%花椒籽飼喂的杜×（長h大）三元雜交育肥豬（各6頭）的小腸（回腸、空腸和十二指腸）組織片段，并立即保存于10%標(biāo)準(zhǔn)甲醛固定液，保持小腸（回腸、空腸和十二指腸）組織形態(tài)完好。

1.2.2 制作組織切片

1）脫水：固定組織經(jīng)全自動脫水機(jī)脫水，脫水酒精濃度及脫水時(shí)間見表1。

表1 脫水酒精濃度及脫水時(shí)間 h

2）透明：將經(jīng)脫水處理的組織塊浸入二甲苯（透明劑）溶液中浸泡 10 min，再將組織塊取出再次浸入二甲苯溶液中10 min進(jìn)行透明。

3）包埋：透明處理后，立即將組織塊投入到預(yù)先融化的石蠟液中，58 ℃浸漬1 h、2 h、3 h，待石蠟完全包埋組織塊后，迅速夾取組織塊置于提前準(zhǔn)備好的、預(yù)熱的金屬模具中，并倒入浸沒組織塊的石蠟液進(jìn)行冷卻。

我們本該明白教育應(yīng)做什么：智育是要發(fā)展好奇心和理性思考的能力，而不是灌輸知識；德育是要鼓勵(lì)崇高的精神追求，而不是鼓吹規(guī)范；美育是要培育豐富的靈魂，而不是傳授技藝。

4）切片：待包埋石蠟的組織塊完全冷卻變硬后，小心從模具中取出包埋塊，并置于切片機(jī)上切片，切片厚度以4～5 μm為宜。

1.2.3 HE常規(guī)染色

1）脫蠟、復(fù)水：將組織切片依次經(jīng)過以下溶液脫蠟復(fù)水，處理溶液及時(shí)間見表2。

表2 脫蠟、復(fù)水處理溶液及所需時(shí)間 min

2）染色：實(shí)驗(yàn)采用 H.E 染色方法，選用蘇木精-伊紅染色劑，在 35 ℃條件下，將脫蠟后的組織切片按照HE常規(guī)染色進(jìn)行染色。如表3所示。

表3 HE染色處理溶液及所需時(shí)間

1.2.4 封片

將切片從二甲苯中取出稍微晾干，然后滴加中性樹膠封片（取中性樹膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下，避免產(chǎn)生氣泡），最后利用顯微鏡進(jìn)行鏡檢，觀察組織形態(tài)上發(fā)生的改變。

1.2.5 圖像采集及測量

采用濟(jì)南丹吉爾電子有限公司生產(chǎn)的pannoramic 250型全景數(shù)字幻燈片掃描儀對切片進(jìn)行圖像采集，采集圖像時(shí)先在低倍鏡下觀察全部組織，然后再選擇要觀察的區(qū)域在40倍鏡下采集圖片。用Caseviewer圖像分析軟件Annotation中的Draw an open polygon測量工具對各組織的絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度、腸壁厚度進(jìn)行測量并記錄。

1.2.6 數(shù)據(jù)整理與分析

試驗(yàn)共測量小腸組織（空腸、回腸、十二指腸）的絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度和腸壁厚度四個(gè)指標(biāo)，將所測得的數(shù)據(jù)整理到Excel表格中，計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值；再用SPSS26.0中的單因子方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)各組間的差異顯著性，結(jié)果表示為平均值f標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒籽對回腸組織形態(tài)的影響

由表4和圖1可知，試驗(yàn)組與對照組的回腸組織絨毛高度、隱窩深度、腸壁厚度和絨隱比均存在顯著差異（P＜0.05），而絨毛寬度無顯著差異（P＞0.05）；試驗(yàn)組的絨毛高度為542.91 μm，顯著高于對照組的370.39 μm ，隱窩深度為214.37 μm，顯著低于對照組的515.15 μm，絨隱比為2.59，顯著高于對照0.80。試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼糧中添加5%花椒籽可以顯著增加回腸絨毛高度、降低隱窩深度。

表4 試驗(yàn)組與對照組回腸組織測量結(jié)果 μm

圖1 試驗(yàn)組與對照組回腸組織切片結(jié)果

2.2 花椒籽對空腸組織形態(tài)的影響

由表5和圖2可知，試驗(yàn)組與對照組生長育肥豬的空腸腸壁厚度存在顯著差異（P＜0.05），絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度和絨隱比均無顯著差異（P＞0.05），添加5%花椒籽的腸壁厚度為448.35μm，顯著高于對照組325.94 μm。試驗(yàn)表明，飼糧中添加5%花椒籽可以顯著增加空腸的腸壁厚度，從而加強(qiáng)空腸的消化吸收能力。

圖2 試驗(yàn)組與對照組空腸組織切片結(jié)果

表5 試驗(yàn)組與對照組空腸組織測量結(jié)果 μm

2.3 花椒籽對十二指腸組織形態(tài)的影響

由表6和圖3可知，試驗(yàn)組與對照組的十二指腸的隱窩深度、絨毛寬度和絨隱比存在顯著差異（P＜0.05），絨毛高度和腸壁厚度無顯著差異（P＞0.05）；添加5%花椒籽的隱窩深度347.69 μm，顯著高于對照258.14 μm，絨毛寬度為94.01 μm，顯著低于對照177.75 μm，絨隱比值為1.20，顯著低于對照1.56。試驗(yàn)表明，飼糧中添加5%花椒籽可以顯著增加十二指腸的隱窩深度，降低絨毛寬度和絨隱比。

圖3 試驗(yàn)組與對照組十二指腸組織切片結(jié)果

表6 試驗(yàn)組與對照組十二指腸測量結(jié)果 μm

3 討論

花椒樹作為一種我國本土常綠植物，在我國普遍種植，花椒籽作為花椒的主要副產(chǎn)物，占花椒總量的60%左右，是一種含油量和蛋白質(zhì)資源非常豐富的作物[9]?；ń烦吮娝苤目梢杂米髡{(diào)味品之外，《本草綱目》中還記載其可以作藥用，可用于治療腹痛、感冒、嘔吐、腹瀉和濕疹，對一些作物害蟲有麻痹、驅(qū)逐、預(yù)防的作用?；ń窐鋫?cè)根發(fā)達(dá)，形成復(fù)雜的網(wǎng)狀根系，可以發(fā)揮防風(fēng)固壩和防止水土流失的作用[10]。黃鵬等報(bào)道[2]、付興周等[6]的試驗(yàn)研究表明，花椒籽粉可以提高肉雞的生產(chǎn)性能、免疫器官指數(shù)、改善肉品質(zhì)，因此花椒籽粉可以直接用作飼料添加劑。

小腸作為消化系統(tǒng)的重要組成部分，其絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度、腸壁厚度是衡量消化能力的重要指標(biāo)。絨毛高度與隱窩深度的比值能更加直觀地體現(xiàn)小腸組織的消化吸收能力，絨隱比下降，意味著消化能力降低，同時(shí)會產(chǎn)生腹瀉等病癥現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)會使動物的正常生長發(fā)育受到損害；絨隱比上升，意味著消化能力增強(qiáng)，可明顯減少動物腹瀉現(xiàn)象，促進(jìn)動物正常的生長發(fā)育[11]。小腸正常的絨毛結(jié)構(gòu)有利于豬只營養(yǎng)物質(zhì)的消化，絨毛越寬越高，絨毛密度越大，保證腸道的有效利用表面積；腸道隱窩是腸道細(xì)胞繁殖分裂最活躍的組織，隱窩深度反映了小腸上皮的更新速度，隱窩深度變淺意味著上皮細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增加[12]。這與王子旭[13]、劉秋東[14]、雷麗[15]等的報(bào)道一致，絨毛高度和絨毛寬度增加，會增加小腸組織的腸道表面積，從而提高腸道組織的消化吸收能力，而隱窩深度與小腸上皮絨毛細(xì)胞有關(guān)，隱窩深度越淺，消化能力越強(qiáng)。Kim等[16]發(fā)現(xiàn)在小鼠日糧中添加5%菊粉后其回腸絨毛顯著加長，有效改善回腸組織形態(tài)；Mathlouthi等[17]報(bào)道飼喂黑麥日糧的肉仔雞，其回腸絨毛高度、絨毛寬度和表面積均會下降，添加木聚糖酶可以改善回腸絨毛形態(tài)，并提高絨隱比。利凱等[18]研究表明，斷奶仔豬腹瀉和體重下降的主要原因是小腸絨毛高度、絨毛寬度和腸壁厚度降低，添加復(fù)方中藥豬痢停后，小腸組織的絨毛高度、絨毛寬度和腸壁厚度明顯升高，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，明顯改善腸道組織，減少斷奶仔豬腹瀉的發(fā)生，增加斷奶仔豬的體重。John等[19]研究表明，斷奶仔豬飼喂豆粕飼料會提高絨毛高度，改善絨毛結(jié)構(gòu)，促進(jìn)消化吸收；鮑偉光等[20]的試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加硫辛酸，可以有效增加空腸和十二指腸的絨毛高度；吳維達(dá)等[21]試驗(yàn)結(jié)果表明，將菊粉添加到豬只日糧中，可以使其回腸和十二指腸的絨毛高度增加，隱窩深度降低，絨隱比提高，有效改善了十二指腸和回腸的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

本試驗(yàn)中，采用單因素分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，通過HE染色方法，對生長育肥豬的小腸組織（回腸、空腸和十二指腸）的絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、腸壁厚度和絨隱比進(jìn)行了測量計(jì)算并分析，結(jié)果顯示，在生豬育肥豬飼糧中添加5%花椒籽替代玉米，可以使其回腸的絨毛高度和絨隱比顯著增加；空腸的絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度等指標(biāo)無顯著變化，但腸壁厚度顯著增加；與上述研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)研究表明，在生長育肥豬飼糧中添加5%的花椒籽代替玉米，可以顯著提高其回腸的絨毛高度和腸壁厚度，降低隱窩深度，提高絨隱比，增加空腸的腸壁厚度，提高十二指腸的絨隱比。由此可見花椒籽可能具有促進(jìn)豬只消化吸收的功能。