李 娜，馬玉潔，劉 楠，王珊珊，周德慶

（中國水產科學研究院黃海水產研究所 山東青島 266071）

魚鰾，又名花膠或魚肚，以其膠原蛋白含量極高而著稱，自古以來因各種功效顯著而受到頗多消費者的喜愛[1-2]。相關研究報道，通過酶解魚鰾制備的多肽具有較高的抗氧化活性[3-4]。對氧化與衰老的關系，有研究表明，提高機體抗氧化能力是延緩衰老的最佳途徑之一[5]。與傳統(tǒng)抗氧化劑相比，來自海洋生物的新型肽，因具有高抗氧化活性，更好的生物相容性和更低的毒性而受到越來越多的關注[6-7]。對多肽與延緩機體衰老的關系探討成為近年的研究熱點。

生物體的衰老發(fā)生在機體的每一個層面，包括從細胞、組織到器官。細胞是生命的基本組成單位，細胞衰老被認為是人類衰老的基礎。細胞衰老分為早期衰老與復制性衰老兩種。復制性衰老即細胞復制過程中會產生端?？s短的現(xiàn)象，最終導致細胞分裂能力減弱。早期衰老是當細胞遭受外界干擾發(fā)生永久不可逆的增殖停滯現(xiàn)象。在衰老相關模型的研究中，人胚肺二倍體成纖維細胞往往被選為模式細胞種類，而且通過H2O2誘導細胞建立早期衰老細胞模型更易于體外模擬衰老進程的研究[8-9]。本研究通過建立H2O2誘導的2BS 細胞早期衰老細胞模型，檢測細胞的增殖率、細胞凋亡情況與β-半乳糖苷酶含量等衰老相關指標，探討鱈魚鰾膠原肽對早熟性細胞衰老進程的影響。同時檢測ROS 活性氧水平與抗氧化酶含量等，探討其可能通過對抗氧化系統(tǒng)的保護作用實現(xiàn)對細胞早期衰老進程的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱈魚鰾（凍鮮品），平均質量10.44 g/只，由青島海洋兄弟食品有限公司提供。人胚胎肺二倍體成纖維細胞（2BS 細胞），江蘇凱基生物科技股份有限公司。

復合蛋白酶、ROS 活性氧試劑盒、Hoechst 染色試劑盒、β-半乳糖苷酶試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；SOD、CAT、MDA 試劑盒，南京建成生物公司。

可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；pH計，梅特勒-托利多（上海）有限公司；倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；智能活細胞成像分析系統(tǒng)，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鱈魚鰾膠原肽的制備 將鱈魚鰾原料解凍后洗凈，剪成0.5 cm×0.5 cm 的小塊，加入10 倍體積0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，于4 ℃條件下攪拌溶脹48 h 后，除去非膠原成分的雜蛋白。洗凈后加入10 倍體積蒸餾水勻漿，將pH 值調至中性，按100 U/mL 比例加入復合蛋白酶，于55 ℃水浴條件下酶解4 h，于100 ℃水浴加熱10 min 滅酶活，旋轉蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到鱈魚鰾膠原肽，命名為SWP[10]。

1.2.2 2BS 細胞的培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的MEMNEAA 培養(yǎng)基培養(yǎng)2BS 細胞，于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至對數期，傳代。調整細胞含量至2×104/mL，取90 μL，加入96 孔板中制成2×103/孔的細胞懸液，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當96 孔板單孔中細胞密度達到50%時，加入不同質量濃度的SWP（800，400，200，100，50，10 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后采用cck-8 法檢測細胞增殖率，評價SWP 的細胞毒性篩選適宜的給藥濃度[11]。

細胞增殖率（%） =（OD藥物-OD藥物對照）/（OD空白-OD空白對照）×100

1.2.3 H2O2誘導2BS 細胞早期衰老細胞模型的建立 細胞培養(yǎng)方法同上。使用不同濃度的H2O2誘導對數生長期2BS 細胞，培養(yǎng)24 h 后，檢測不同濃度鱈魚鰾膠原肽對細胞增殖率的影響，細胞增殖率計算方法同上。

1.2.4 ROS 活性氧水平測定 本試驗共分6 組，空白對照組（無H2O2，不給藥）、氧化誘導模型組（含H2O2，不給藥）和藥物干預組（含H2O2，給藥）。以10 μmol/L 白藜蘆醇（Res）為陽性對照。誘導完成后藥物干預組各加入10 μL 不同濃度的藥物，對經H2O2誘導的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照試劑盒說明書中原位裝載探針的方法將10 μL 稀釋1 000 倍的DCFH-DA 探針加入處理過的細胞中，于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min 后，用不含胎牛血清的MEM-NEAA 培養(yǎng)基清洗細胞，加入100 μL PBS，用熒光酶標儀檢測每組細胞的熒光強度，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm，同時使用智能活細胞成像分析系統(tǒng)對細胞狀態(tài)進行熒光拍照[12]。

1.2.5 Hoechst 33258 染色 試驗分組同上。采用6 孔板培養(yǎng)2BS 細胞。將H2O2誘導的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入固定液對細胞進行固定，洗去固定液，加入預先用PBS 稀釋的Hoechst 33258 染色液。置室溫3～5 min 后洗去染色液，用顯微鏡觀察。激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm[13]。

1.2.6 β-半乳糖苷酶含量測定 試驗分組及細胞處理方式同上。將H2O2誘導的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸出細胞培養(yǎng)液，加入固定液，室溫固定15 min。用PBS 洗滌細胞，按比例加入染色工作液，6孔板四周用parafilm 膜封好，于37 ℃恒溫箱中過夜。24 h 后吸出染色液，加入PBS，用光學顯微鏡觀察，細胞中有藍色物質生成的為表達β-半乳糖苷酶的細胞，隨機抽取5 個區(qū)域進行細胞計數[14]。

1.2.7 過氧化物酶含量測定 試驗分組同上。采用25 cm2細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)2BS 細胞。處理后的細胞用胰酶消化，超聲破碎，收集細胞液，檢測蛋白濃度，按照試劑盒說明檢測SOD、CAT 以及MDA含量[15]。

1.2.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 安全性評價結果

細胞增殖試驗可反應受試物的細胞毒性，可通過該試驗對鱈魚鰾膠原肽的安全性進行評價。已知細胞毒性的評判等級可分為5 級：0 級：增殖率≥100%；I 級：增殖率75%～99%；II 級：增殖率50%～74%；III 級：增殖率25%～49%；IIII 級：增殖率1%～24%；V 級：0。結果顯示，質量濃度10～800 μg/mL 鱈魚鰾膠原肽的細胞增值率均超過100%，說明鱈魚鰾膠原肽無細胞毒性，在一定濃度范圍內對2BS 細胞增殖有促進作用。

圖1 鱈魚鰾膠原肽對2BS 細胞增殖率的影響Fig.1 Cell viability of 2BS cells treated with SWP

2.2 H2O2 濃度的選擇

有研究表明，一定濃度的H2O2可使人二倍體成纖維細胞發(fā)生衰老退行性改變，且不表現(xiàn)細胞死亡，該狀態(tài)的細胞適宜用于早期衰老細胞模型研究[16]。為選擇適合的H2O2誘導濃度，檢測加入不同濃度H2O2后細胞的增殖率。由圖2可以看出，與空白組細胞相比，加入0.1 mmol/L H2O2的細胞增殖率超過100%，隨著濃度的進一步增大，細胞增殖率逐漸降低，當H2O2濃度為0.2 mmol/L 時，細胞增殖率為80.1%；當H2O2濃度為5 mmol/L時，細胞增殖率僅1.3%。上述結果表明H2O2對細胞的增殖具有雙向調節(jié)作用，低濃度促進細胞增殖，高濃度抑制細胞增殖。王昌等[17]在試驗中觀察到類似的現(xiàn)象，他指出H2O2對細胞的影響取決于細胞類型和誘導劑量。細胞增殖率過低不利于藥效的發(fā)揮，影響后續(xù)試驗的進行。本試驗采用0.2 mmol/L H2O2建立早期衰老模型。

圖2 不同濃度H2O2 誘導2BS 細胞的增殖率（±s，n=4）Fig.2 Cell viability of H2O2-induced 2BS cells （±s，n=4）

2.3 SWP 對2BS 細胞存活率的影響

由圖3可看出，與模型組細胞相比，H2O2誘導的2BS 細胞經SWP 或白藜蘆醇處理后細胞增殖率提高，且呈一定的劑量依賴。當SWP 質量濃度為200 μg/mL 時，細胞增殖率為79.8%，具有顯著性差異（P＜0.01）。這表明一定濃度的鱈魚鰾膠原肽對H2O2誘導的2BS 細胞增殖有促進作用。

圖3 鱈魚鰾膠原肽分離純化組分對H2O2 誘導2BS細胞增殖率的影響（±s，n =4）Fig.3 Effects of SWP on cell viability of H2O2-induced 2BS cells（±s，n=4）

2.4 ROS 活性氧

1956年，Harman 首次提出自由基致衰老學說，最早闡釋了氧自由基與衰老之間的關聯(lián)[18]。當體內多余的ROS 活性氧自由基不能被及時清除時，會對機體產生一定的傷害。采用DCFH-DA 探針標記細胞，非熒光的DCFH 被自由基氧化后形成熒光DCF，通過熒光強度檢測可反映細胞中活性氧自由基含量變化[19]。本試驗結果如圖4b 所示，用H2O2處理后，2BS 細胞的ROS 生成明顯增加（P＜0.01）。從圖4a 的細胞形態(tài)也可以看出，模型組細胞中被熒光染料染色的細胞數量多，熒光強度大。與模型組細胞相比，經SWP 與白藜蘆醇處理的細胞中ROS 活性氧含量顯著下降（P＜0.01），且SWP 濃度越大，下降越顯著。以上結果顯示鱈魚鰾膠原肽能夠清除H2O2誘導細胞產生的ROS 活性氧自由基，對早衰細胞起到保護作用。

圖4 鱈魚鰾膠原肽對H2O2 誘導2BS 細胞ROS 活性氧的影響（±s，n =4）Fig.4 Effects of SWP on H2O2-induced ROS generation of 2BS cells（ xˉ±s，n=4）

2.5 Hoechst 33258 染色

Hoechst 33258 作為一種可穿透細胞膜的具有熒光特性的核酸染料，常被用于DNA 染色，觀察細胞凋亡情況[20]。染色結果如圖5所示，未經處理的空白組中細胞形態(tài)規(guī)則且呈均勻的藍色熒光。經H2O2誘導處理后，細胞數量明顯減少，細胞大小不均一且細胞核濃染數量較多，顏色發(fā)白、發(fā)亮，可見細胞核固縮或碎裂為小核等典型的細胞凋亡形態(tài)特征。與模型組細胞相比，陽性藥組與SWP 處理組細胞數量有一定程度的增加，濃染細胞數減少，且高濃度SWP 對早衰2BS 細胞的保護作用更顯著。試驗結果表明鱈魚鰾膠原肽對H2O2誘導2BS 細胞產生的細胞凋亡具有較好的抑制作用。

圖5 鱈魚鰾膠原肽對H2O2 誘導2BS 細胞Hoechst 33258 染色的影響Fig.5 Effects of SWP on Hoechst 33258 staining of H2O2-induced 2BS cells

2.6 β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是一種存在于動物中的常用來評價細胞衰老水平的生物標志物[21]。本試驗采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）染料，經細胞內的β-半乳糖苷酶催化后生成藍色產物，在光學顯微鏡下很容易被觀察到。通過對染色細胞計數可以檢測和量化衰老細胞。隨機抽取5 個視野，計數染色細胞，計算染色細胞占總細胞數比例。細胞形態(tài)與統(tǒng)計結果見圖6?？梢钥闯觯汬2O2誘導處理的細胞形態(tài)發(fā)生變化，SA-β-gal 陽性細胞數量顯著增多（P＜0.01），達到細胞總數的54.8%。與模型組細胞相比，陽性藥組與SWP 處理組細胞中SA-β-gal 陽性細胞數量顯著減少（P＜0.01），且呈現(xiàn)良好的劑量依賴關系。400 μg/mL SWP 組細胞中染色陽性率與白藜蘆醇組相近，為33.8%。該結果顯示鱈魚鰾膠原肽對H2O2導致的細胞中β-半乳糖苷酶升高具有顯著的抑制作用。

圖6 鱈魚鰾膠原肽對H2O2 誘導2BS 細胞β-半乳糖苷酶含量染色的影響（±s，n = 5）Fig.6 Effects of SWP on SA-β-gal staining of H2O2-induced 2BS cells （±s，n=5）

2.7 抗氧化酶活力

人體內存在復雜的抗氧化防御網絡，主要通過內源性酶和非酶抗氧化劑來調節(jié)。這些分子共同作用，將體內多余的自由基轉化成為穩(wěn)定的無害化合物，使機體的氧化-還原狀態(tài)維持在較為平穩(wěn)的狀態(tài)[22]。過氧化物酶，如超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等構成人體抗氧化防御體系的第一道防御系統(tǒng)。丙二醛（MDA）是自由基與脂質發(fā)生過氧化反應的重要產物，具有明顯的細胞毒性，可反映機體因自由基而導致的氧化損傷。細胞中SOD、CAT 活力及MDA 含量檢測結果見表1。與空白組細胞相比，模型組細胞中SOD與CAT 活力顯著降低（P<0.01），MDA 含量顯著升高（P<0.01）。與模型組細胞相比，陽性藥組與SWP處理組細胞中SOD 與CAT 活力不同程度地增大，MDA 含量有降低趨勢，其中400 μg/mL SWP 組對提高氧化損傷細胞中SOD 與CAT 活力的效果最顯著（P<0.01），200 μg/mL SWP 組對降低氧化損傷細胞中MDA 含量的效果最顯著（P<0.01）。以上結果顯示，鱈魚鰾膠原肽通過調節(jié)抗氧化酶活力并降低脂質過氧化物含量來實現(xiàn)對早期衰老細胞的保護作用。

表1 過氧化物酶含量變化Table 1 The changes of peroxidase content

3 結論

本研究結果表明，對H2O2誘導的早期衰老的2BS 細胞，用鱈魚鰾膠原肽處理后能夠提高細胞增殖率，降低細胞ROS 活性氧水平與β-半乳糖苷酶含量，減少細胞凋亡率，提高細胞內抗氧化酶活力并降低脂質過氧化物含量，說明鱈魚鰾膠原肽能延緩衰老，是因其具有抗氧化活性及抑制細胞凋亡作用。