王 晶，宋云飛

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)由膜組成的一系列片狀的囊腔和管狀的腔，彼此相通形成一個(gè)隔離于細(xì)胞基質(zhì)的管道系統(tǒng)，為細(xì)胞中的重要細(xì)胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能主要在于為蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及加工提供場(chǎng)所，其中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還與記憶有關(guān)。但是當(dāng)細(xì)胞遭受缺氧缺血、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩或缺失、鈣超載等因素時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能會(huì)受到影響，導(dǎo)致折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白增多引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡[1-2]。研究[3-5]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。所以開(kāi)發(fā)一些臨床上常用的抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激試劑對(duì)于上述疾病的治療有一定的意義。

?；撬崾菣C(jī)體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸之一，是中藥牛黃的活性成分，具有保護(hù)視網(wǎng)膜、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝、調(diào)節(jié)腦內(nèi)滲透壓等多種生理作用，并且在神經(jīng)系統(tǒng)中?；撬徇€可充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)因子的作用以對(duì)抗神經(jīng)興奮毒性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6]。羅濟(jì)璇等[7]發(fā)現(xiàn)，?；撬嵬ㄟ^(guò)下調(diào)GRP78和CHOP的表達(dá)來(lái)減輕斑馬魚(yú)腦缺血再灌注導(dǎo)致的損傷。成蘭云等[8]也表明?；撬峥梢种苾?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮缺血再灌注肺損傷的保護(hù)作用。然而，牛磺酸是否能通過(guò)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用減輕細(xì)胞凋亡達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用尚不清楚。所以本實(shí)驗(yàn)利用毒胡蘿卜素（TG）誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激應(yīng)激細(xì)胞模型，觀測(cè)?；撬釋?duì)TG誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑Thapsigargin（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：T9033）；?；撬幔绹?guó)Sigam公司，貨號(hào)：T0625）；4-PBA（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：P21005）；MTT（阿拉丁試劑公司，貨號(hào)：T100896）；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)：KGA7061）；鼠抗GRP78（貨號(hào)：66574-1-Ig）和GAPDH（貨號(hào)：60004-1-Ig）抗體（美國(guó)Proteintech公司）；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C1115）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記驢抗鼠IgG（貨號(hào)：A0216）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：P0012）和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）（貨號(hào)：P0015）（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.1.2 儀器 倒置熒光生物顯微鏡（上海普丹公司，F(xiàn)M-600）；超低溫離心機(jī)（廣州吉迪公司，JIDI-16R）；超低溫冰箱（青島海爾公司，DW-86L578S）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo，1410101）；Western blotting電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，1703811）；顯影儀（美國(guó)Azure Biosystems公司，Azure C300）。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) 將SH-SY5Y細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）置于含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并在含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2 d左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 TG誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型的制備 將SH-SY5Y細(xì)胞以106個(gè)/mL的密度接種于多聚賴(lài)氨酸（PDL）包被的96孔白底板中，每孔150 μL。將細(xì)胞分為0、1、3、5、10、30、50 μmol/L的TG組，每組6個(gè)孔，其中0為對(duì)照組。待細(xì)胞長(zhǎng)成至80%～90%時(shí)，吸干培養(yǎng)基，加入含有相應(yīng)濃度的TG培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活情況 吸去96孔板中各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，每孔加入含有終濃度0.5 mg/mL的MTT的培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，2 h后棄去各孔細(xì)胞的上清液，每孔加入150 mL的DMSO溶液在搖床上慢搖10 min直至藍(lán)紫色結(jié)晶全部溶解，用酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度，以對(duì)照組的存活率為100%，計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。

1.2.4 細(xì)胞分組 將SH-SY5Y細(xì)胞以106個(gè)/mL的密度接種于PDL包被的96孔白底板中，每孔150 μL。將細(xì)胞分為對(duì)照組、TG組、TG+10 μmol/L?；撬峤M、TG+20 μmol/L?；撬峤M及TG+5 mmol/L 4-PBA陽(yáng)性藥組。各組藥物與TG共同孵育24 h，觀察?；撬釋?duì)TG致細(xì)胞損傷的保護(hù)情況。

1.2.5 TUNEL法觀測(cè)各組細(xì)胞中凋亡情況 吸去96孔板中各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入適量的4%多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，5 min/次；加入1%Triton X-100透化10 min，1×PBS洗3次，5 min/次；加入50 μL TdT酶反應(yīng)液，37℃避光反應(yīng)1 h，1×PBS洗3次，5 min/次；加入50 μL Streptavidin-TRITC標(biāo)記液，37℃避光反應(yīng)30 min，1×PBS洗3次，5 min/次；DAPI染色液孵育切片，室溫避光反應(yīng)10 min；加適量抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase-3活性 吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，備用。用胰酶消化細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中。600 g 4℃離心5 min收集細(xì)胞，小心吸除上清，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬(wàn)細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。4℃20 000 g離心10～15 min，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。按照Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase-3活性。

1.2.7 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中GRP78和CHOP蛋白表達(dá) 在每孔的細(xì)胞中加入蛋白裂解液和終濃度為1 mmol/L的PMSF，在冰上裂解30 min。然后將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4℃條件下12 000 r/min離心15 min，取少量上清液用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。各組蛋白調(diào)整至等濃度后，用5倍的蛋白上樣緩沖液稀釋?zhuān)琒DS-PAGE電泳分離。用320 mA恒流條件下1 h將膠上的蛋白用轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的Caspase-3和GAPDH一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后，加入二抗置搖床上室溫孵育1 h，采用ECL發(fā)光后膠片暗室曝光顯影。用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的光密度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算分析，Graphpad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖的繪制。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的TG對(duì)SH-SY5Y存活能力的影響 與對(duì)照組比較，給予1～50 μmol/L的TG能明顯降低SH-SY5Y細(xì)胞的存活能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中給予10 μmol/L的TG能明顯使SH-SY5Y細(xì)胞的存活能力處于（53.0±2.37）%的亞健康狀態(tài)[10]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇TG劑量10 μmol/L作為致SHSY5Y細(xì)胞損傷的劑量。（見(jiàn)圖1）

圖1 不同濃度TG對(duì)SH-SY5Y存活能力的影響（±s，n=6）

2.2牛磺酸改善TG致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的形態(tài) 對(duì)照組細(xì)胞貼壁較好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，上皮樣形態(tài)明顯，折光性較好，細(xì)胞較健康。TG組細(xì)胞貼壁狀態(tài)很差，皺縮明顯，細(xì)胞個(gè)數(shù)較對(duì)照組明顯減少，鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)基中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不明顯，呈長(zhǎng)條狀。而給予不同濃度的?；撬岷?-PBA的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)較TG組明顯有所改善，細(xì)胞個(gè)數(shù)也變多，貼壁較良好。（見(jiàn)圖2）

圖2 各組SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)（×200）

2.3 ?；撬崽岣逿G損傷SH-SY5Y細(xì)胞的存活能力TG組細(xì)胞的存活率低于TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)不同濃度?；撬岣深A(yù)后的TG損傷細(xì)胞存活率均高于TG組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（見(jiàn)表1）

表1 各組細(xì)胞的存活率、調(diào)亡率、Caspase-3活性比較（±s，n=6）

表1 各組細(xì)胞的存活率、調(diào)亡率、Caspase-3活性比較（±s，n=6）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與TG組比較，bP＜0.01，cP＜0.05

組別 存活率（%） 凋亡率（%）Caspase-3活性（mg/g）對(duì)照組TG組TG+10μmol/L牛磺酸組TG+20μmol/L?；撬峤MTG+4-PBA組100.00±2.29 49.20±4.04a 65.90±3.34b 72.10±4.19b 83.40±2.50b 5.00±0.57 20.70±5.40a 17.30±3.92c 13.40±1.29b 7.20±0.44b 5.50±0.41 15.70±1.40a 11.30±1.34b 9.66±0.83b 7.52±0.41b

2.4 ?；撬釡p少TG致SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡TG組凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而?；撬岣深A(yù)后TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低，且濃度越高，凋亡細(xì)胞數(shù)越少，與TG組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。（見(jiàn)圖3、表1）

圖3 TUNEL染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

2.5 牛磺酸抑制TG致SH-SY5Y細(xì)胞中Caspase-3活性TG組細(xì)胞的Caspase-3活性高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)不同濃度?；撬岣深A(yù)后的TG損傷細(xì)胞Caspase-3活性均低于TG組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（見(jiàn)表1）

2.6 ?；撬嵋种芓G致SH-SY5Y細(xì)胞中GRP78和CHOP的蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，TG組GRP78和CHOP的蛋白表達(dá)明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與TG組比較，給予不同濃度?；撬岣深A(yù)后GRP78和CHOP的蛋白表達(dá)明顯降低，說(shuō)明?；撬崮軌蛞种芓G致SH-SY5Y細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的活化。（見(jiàn)圖4、表2）

圖4 各組細(xì)胞GRP78和CHOP蛋白表達(dá)情況

表2 各組細(xì)胞GRP78和CHOP蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）

表2 各組細(xì)胞GRP78和CHOP蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與TG組比較，bP＜0.01

組別 GRP78 CHOP對(duì)照組TG組TG+10 μmol/L牛磺酸組TG+20 μmol/L?；撬峤MTG+4-PBA組1.00±0.05 3.48±0.15a 2.73±0.17b 1.95±0.18b 1.27±0.26b 1.00±0.10 2.84±0.25a 2.21±0.27b 1.75±0.16b 1.11±0.11b

3 討 論

細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是由細(xì)胞膜上的離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)調(diào)節(jié)的，保證細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的平衡。肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶（SERCA）對(duì)鈣離子的調(diào)控在起著重要作用。SERCA蛋白大部分結(jié)構(gòu)朝向細(xì)胞內(nèi)腔，含有鈣離子和結(jié)合位點(diǎn)和ATP水解位點(diǎn)。當(dāng)信號(hào)到達(dá)細(xì)胞時(shí)，鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量釋放，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣濃度過(guò)高，這時(shí)SERCA通過(guò)ATP的水解將胞漿內(nèi)多余的鈣離子逆濃度地轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存起來(lái)，從而準(zhǔn)備下一個(gè)效應(yīng)到來(lái)[9]。TG是一種非競(jìng)爭(zhēng)性、細(xì)胞膜滲透性的SERCA介導(dǎo)的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，對(duì)SERCA的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在本研究中，首先采用0～50 μmol/L的TG孵育SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞24 h，通過(guò)細(xì)胞的存活率來(lái)篩選構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激應(yīng)激細(xì)胞模型的濃度。結(jié)果表明1 μmol/L的TG就已經(jīng)降低了SH-SY5Y細(xì)胞的存活能力，且TG的濃度越高，細(xì)胞的存活率越低，TG的濃度到50 μmol/L時(shí)細(xì)胞基本死亡。不僅如此，TG的濃度在1～10 μmol/L時(shí)細(xì)胞的存活率接近線性變化，其中10 μmol/L組的存活率在50%左右，說(shuō)明細(xì)胞正處于亞健康狀態(tài)，存活率太高或太低都不能說(shuō)明藥物的治療作用[10]，所以本實(shí)驗(yàn)就采用了10 μmol/L的TG構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)牛磺酸對(duì)其的保護(hù)作用。

由于?；撬嵩诖竽X中具有多效性作用，牛磺酸被廣大研究者認(rèn)為是治療神經(jīng)疾病和精神疾病的潛在治療分子。由于?；撬峥梢栽谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中起到抑制性神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的作用，因此有人提出了?；撬釋?duì)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用[11]。這一事實(shí)說(shuō)明谷氨酸興奮性毒性與腦損傷和神經(jīng)退行性疾病有著密切關(guān)系[12]。與健康人比較，接受奧氮平治療的精神分裂癥患者血漿中的?；撬崴礁遊13]。電生理數(shù)據(jù)表明，牛磺酸通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)NMDA受體，從而抑制NMDA誘發(fā)的反應(yīng)[14]。牛磺酸不僅通過(guò)與NMDA受體的直接相互作用，而且通過(guò)其在大腦中的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，降低MK-801誘導(dǎo)的記憶缺陷和刻板行為。牛磺酸作為GABAA和甘氨酸受體的激動(dòng)劑增強(qiáng)了抑制信號(hào)傳導(dǎo)[15]。此外，?；撬峥勺柚构劝彼嵴T導(dǎo)的膜去極化，并抑制通過(guò)L-、P/Q-、N-型電壓門(mén)控鈣通道的鈣內(nèi)流。此外，?；撬嵩谟洃浵嚓P(guān)過(guò)程中的神經(jīng)保護(hù)作用也已經(jīng)得到了證實(shí)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛磺酸能改善TG誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的形態(tài)，促進(jìn)其存活，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白質(zhì)響應(yīng)（unfolded protein response，UPR），通過(guò)清除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)或使未折疊蛋白質(zhì)正確折疊，讓內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遭受的壓力變小，功能得以恢復(fù)[17-18]。UPR的具體效應(yīng)主要是堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的未折疊蛋白質(zhì)或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)作為信號(hào)，活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的GRP78，使GRP78與膜上效應(yīng)蛋白解離，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)優(yōu)先與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，使其正確折疊，讓細(xì)胞適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。但強(qiáng)烈持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)將啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡途徑來(lái)清理這些“妥協(xié)的細(xì)胞”，如CHOP蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡信號(hào)分子，是ER-stress細(xì)胞凋亡反應(yīng)的直接結(jié)果[19-20]。伴隨一些凋亡蛋白經(jīng)過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)通通進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，以激活Caspase-3為最終目標(biāo)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。所以本研究以GRP78和CHOP表達(dá)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)，探討?；撬嶂委熒窠?jīng)損傷的機(jī)制。結(jié)果顯示TG組細(xì)胞中GRP78和CHOP的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，牛磺酸干預(yù)后GRP78和CHOP增強(qiáng)的作用被抑制。這些證據(jù)都從抑制TG損傷細(xì)胞中Caspase-3的活性來(lái)體現(xiàn)的。為了評(píng)價(jià)牛磺酸是否通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的活化對(duì)TG所致的SH-SY5Y細(xì)胞損傷起保護(hù)作用，本研究額外用了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑4-PBA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-PBA可以基本抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的活化，從而抑制TG誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。

本研究證實(shí)了?；撬釋?duì)TG誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，?；撬崮芨纳剖軗p細(xì)胞的形態(tài)，提高存活能力，減少細(xì)胞凋亡，這種作用與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的活化有關(guān)。但是其具體作用的分子機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步探討研究。