劉 華，鐘天秀

(1.青海省草原總站，青海 西寧 810008；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院草業(yè)科學(xué)系 廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

落地生根(kalanchoedaigremontiana)，原產(chǎn)馬達加斯加，在我國主要分布在福建、臺灣、廣東、廣西、云南等地，喜溫暖潮濕的氣候，宜種植在排水良好的肥沃砂質(zhì)土壤上。落地生根在我國一直作為一種常見的中草藥，用于治療燙傷、急性中耳炎、熱性胃痛等。落地生根葉片寬大肥厚，在葉片周圍形成一圈類似蝴蝶的胎生苗，所以它也作為一種常見的園藝植物應(yīng)用在生活中。落地生根的胎生苗不僅具有園藝觀賞的價值，而且還是研究體細胞胚和器官繁殖的理想模型(H. et al. 2009)。我國目前對胎生苗的研究大部分集中對其形態(tài)解剖學(xué)進行研究(尹秀玲等. 2005；袁強 等. 2006 )，對胎生苗產(chǎn)生的原因及影響因素的研究較少。國外對胎生苗產(chǎn)生的研究也存在爭議，Heide(Heide 1965)認(rèn)為生長素強烈地抑制了落地生根葉片上胎生苗的產(chǎn)生。而其他實驗卻認(rèn)為生長素的抑制作用很弱或者幾乎不產(chǎn)生抑制作用(Karpoff 1982；Yazgan and Vardar 1977)。最近，Kulka(Kulka 2005)重新試驗了各種植物激素對白姬之舞(Kalanchoemarnierianum)產(chǎn)生胎生苗的作用，認(rèn)為細胞分裂素是為維持胎生苗原基休眠的關(guān)鍵激素。白姬之舞是屬于脅迫誘導(dǎo)型產(chǎn)生胎生苗的物種之一，而大葉落地生根屬于半自發(fā)產(chǎn)生胎生苗的類型。目前還沒有研究探討過植物激素對大葉落地生根胎生苗的作用。

所以，本文以大葉落地生根為植物材料，對影響胎生苗產(chǎn)生的激素進行了深入分析，探討激素對胎生苗產(chǎn)生過程所扮演的角色，為進一步研究胎生苗提供理論依據(jù)和實踐支持。

1 材料和方法

1.1 植物材料的準(zhǔn)備

實驗中所用的植物材料均是由同一株大葉落地生根繁殖而成，將大葉落地生根葉片上長出的胎生苗播種在裝有草炭、蛭石和沙(按4∶2∶1混合)的育苗盤中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為14 h光照，10 h黑暗，光照度2 000 Lx。待胎生苗長到約5 cm時，取材待用。另將一部分長到約5 cm的落地生根幼苗，進行干旱處理，獲得胎生苗。

1.2 植物激素的配置

2，4-D、6-BA、生長素抑制劑TIBA(2，3，5-triiodobenzoic acid)、細胞分裂素抑制劑PR (purine riboside)、乙醇、DMSO(二甲基亞砜)等試劑均購于科百奧公司。2，4-D溶于乙醇，配制為2 mg/mL的貯存液，放置于-20 ℃冰箱中待用。6-BA用DMSO溶解，配制為2 mg/mL的貯存液，放置于-20 ℃冰箱中待用。TIBA 在乙醇中溶解后，配制為10 μm/mL 的貯存液，放置于-20 ℃冰箱中待用。PR 溶于水后，配置為100 μm/mL的貯存液，放置于-20 ℃冰箱中待用。

1.3 實驗處理

對大葉落地生根葉片、胎生苗進行表面消毒，依次放入70%的酒精中30 S，2%的次氯酸鈉中10 min，并用無菌水清洗6次。葉片消毒完成之后，取其中一部分葉片切割成約為0.5 cm×0.5 cm的正方形小塊。將3種植物外植體材料(完整葉片、切割葉片、胎生苗)放入培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中含MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog，1962)、8 g/L的瓊脂、3 g/L的蔗糖及2 mg/L的2，4-D和6-BA或10 μm/L TIBA 以及250 μm/L PR。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件同上。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本實驗采用隨機設(shè)計，記錄不同處理下的胎生苗發(fā)生時間和發(fā)生數(shù)量，以及胎生苗的葉幅寬的變化情況。利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型外植體在不同處理情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的表型差異

圖1 不同類型大葉落地生根外植體在不同處理情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗的表型

A)完整葉片在(1)MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型；(2)MS培養(yǎng)基附加2，4-D (2 mg/L)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型；(3)MS培養(yǎng)基附加 6-BA (2 mg/L)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型；(4)MS 培養(yǎng)基同時附加 2，4-D (2 mg/L) 和 6-BA (2 mg/L)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型； (5) MS 培養(yǎng)基附加 TIBA(10 μm/L) 誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型； (6)MS培養(yǎng)基附加 PR(10 μm/L)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型； (7)MS培養(yǎng)基同時附加 2，4-D 和 PR 誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型； (8) MS培養(yǎng)基同時附加 6-BA 和 TIBA 誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型。B)切割葉片在(1)MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型；(2)MS培養(yǎng)基附加2，4-D(2 mg/L)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型；(3)MS培養(yǎng)基附加 6-BA(2 mg/L)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型；(4)MS 培養(yǎng)基同時附加 2，4-D(2 mg/L) 和 6-BA(2 mg/L)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型； (5) MS 培養(yǎng)基附加 TIBA(10 μm/L) 誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型； (6)MS培養(yǎng)基附加 PR(10 μm/L)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型； (7)MS培養(yǎng)基同時附加 2，4-D 和 PR 誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型； (8) MS培養(yǎng)基同時附加 6-BA 和 TIBA 誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型。

通常情況下，胎生苗的發(fā)生部位是葉片邊緣的缺刻處，從葉片頂端向葉柄基部逐漸發(fā)生。生長素(2，4-D)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗類似于愈傷組織，葉片發(fā)育不完全，許多葉片呈一個圓形，葉柄基部膨大，呈白色，出現(xiàn)類似愈傷組織白色透明的組織，僅有少量的能分化出根，大部分分化出的胎生苗就面臨著死亡。細胞分裂素(6-BA)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗，葉片與在對照中一樣，發(fā)育完整。同時添加生長素和細胞分裂素，誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗與只添加生長素中的胎生苗生長情況類似，胎生苗下部膨大，而且葉片發(fā)育不完整，這說明在控制胎生苗表型上，細胞分裂素(6-BA)對生長素(2，4-D)的拮抗作用不明顯。使用生長素抑制劑(TIBA)對完整葉片上誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型沒有影響，但是使在切割葉片誘導(dǎo)的胎生苗表型出現(xiàn)葉片發(fā)育不完整和不對稱的情況，這說明生長素抑制劑在切割葉片中制約相當(dāng)一部分生長素的作用。細胞分裂素抑制劑(PR)對完整葉片上誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗表型沒有影響，但是在切割葉片中，施用細胞分裂素抑制劑(PR)完全抑制了胎生苗的產(chǎn)生。同時使用生長素和細胞分裂素抑制劑，完整葉片上仍然能誘導(dǎo)胎生苗產(chǎn)生，而且不像單獨施用生長素的胎生苗，這些胎生苗的發(fā)育情況較為完整。但是在切割葉片中，沒有發(fā)現(xiàn)胎生苗的產(chǎn)生。同時施用細胞分裂素和生長素抑制劑(TIBA)，在完整葉片和切割葉片上都能誘導(dǎo)產(chǎn)生發(fā)育完全的胎生苗。另外，我們把相同處理的落地生根放在黑暗情況下，發(fā)現(xiàn)沒有光照這個條件，所有外植體都死亡，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗 (照片沒有展示)。由于不定芽產(chǎn)生比較一致，不定根產(chǎn)生的時間比較復(fù)雜，不定根不一定從時間最久的不定芽上最先發(fā)生，有時在時間短的不定芽上反而先長出不定根。我們的研究集中在對不定芽發(fā)育影響的探討上，激素對胎生苗不定根產(chǎn)生及發(fā)育的影響將會在以后的研究中進行敘述。

2.2 以完整葉片作為外植體在不同處理情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的時間和數(shù)量差異

圖2 以大葉落地生根完整葉片作為外植體在不同處理情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的時間和數(shù)量差異

A)不同處理條件下，以大葉落地生根完整葉片為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的時間差異。B)不同處理條件下，以大葉落地生根完整葉片為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的數(shù)量差異。

6-BA和2，4-D都對胎生苗的產(chǎn)生有抑制作用。其中，使用2，4-D后，胎生苗的產(chǎn)生時間推遲2.8 h；2，4-D對胎生苗產(chǎn)生的抑制作用不太明顯，使用TIBA后，胎生苗產(chǎn)生時間推遲2.4 h，對胎生苗產(chǎn)生時間的影響不是很大，說明生長素可能在控制胎生苗產(chǎn)生這個過程中沒有起到主要的作用。使用6-BA后，胎生苗的產(chǎn)生時間推遲13.2 h。PR處理的胎生苗產(chǎn)生時間提前2.4 h。說明在胎生苗產(chǎn)生過程中，細胞分裂素起到了一個相對重要的作用。同時添加2，4-D和PR，胎生苗的產(chǎn)生時間推遲10.8 h；與單獨施用2，4-D相比，對胎生苗產(chǎn)生時間的抑制增加了8 h。說明完整葉片中細胞分裂素和生長素存在著拮抗作用，在抑制細胞分裂素的運輸后，生長素就完全的表現(xiàn)出對胎生苗產(chǎn)生的抑制作用。同時施用6-BA和TIBA，胎生苗的產(chǎn)生時間推遲14.4 h；與單獨施用6-BA相比，對胎生苗產(chǎn)生時間的抑制增加了1.2 h。說明在完整葉片中，生長素對胎生苗產(chǎn)生影響不太，細胞分裂素決定著胎生苗產(chǎn)生的時間。同時施用2，4-D和6-BA，胎生苗的產(chǎn)生時間推遲了9.2 h，與單獨施用6-BA和2，4-D比較，對胎生苗的抑制的作用介于單獨施用細胞分裂素和生長素之間。這說明在完整葉片中細胞分裂素和生長素存在著拮抗作用，同時細胞分裂素在控制胎生苗產(chǎn)生的過程中起決定性作用。

PR處理的外植體，胎生苗產(chǎn)生所需的時間最短，在圖2B中，在2～5 d這段時間內(nèi)，用PR處理產(chǎn)生的胎生苗是最多的。TIBA處理外植體產(chǎn)生的胎生苗總數(shù)，在6～11 d這段時間內(nèi)產(chǎn)生的胎生苗數(shù)最多。這說明了在完整葉片中，細胞分裂素和生長素對胎生苗的誘導(dǎo)產(chǎn)生都存在抑制作用，在施用對應(yīng)的抑制劑PR、TIBA后，胎生苗的產(chǎn)生不再受到抑制，胎生苗的數(shù)量也得到了提高。使用6-BA處理和6-BA、TIBA處理的外植體胎生苗產(chǎn)生所需的時間相對較長，所以，所得到的胎生苗總數(shù)相對較少。

2.3 以切割葉片作為外植體在不同處理情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的時間和數(shù)量差異

圖3 以落地生根切割葉片作為外植體在不同處理情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的時間和數(shù)量差異

與在以大葉落地生根完整葉片為外植體不同，以大葉落地生根切割葉片為外植體，施用6-BA使胎生苗的產(chǎn)生時間提前了3.1 h。說明在切割葉片中，細胞分裂素對胎生苗的產(chǎn)生起到了促進作用。而且用細胞分裂素抑制劑PR處理的切割葉片，胎生苗完全受到抑制。說明在切割葉片中，細胞分裂素對誘導(dǎo)胎生苗產(chǎn)生是至關(guān)重要的，并且有利于胎生苗的產(chǎn)生。 施用2，4-D進行處理，對胎生苗產(chǎn)生時間影響不大，但是施用生長素抑制劑TIBA的處理，胎生苗的產(chǎn)生時間推遲了9.3 h。這些結(jié)果說明在切割葉片中，生長素對胎生苗產(chǎn)生有一個正向的影響。同時用2，4-D和PR處理切割葉片，不能誘導(dǎo)胎生苗產(chǎn)生，說明2，4-D不能挽救無細胞分裂素的情況。同時用6-BA和TIBA處理，胎生苗的產(chǎn)生時間推遲4 h。與單獨施用TIBA相比，6-BA促進了胎生苗的產(chǎn)生；與單獨施用6-BA相比，TIBA的加入使得胎生苗的產(chǎn)生受到抑制，這說明在切割葉片誘導(dǎo)胎生苗產(chǎn)生的過程中，生長素起到了一個不可忽視的作用，抑制生長素的運輸后，胎生苗的產(chǎn)生也受到抑制。

6-BA促進切割葉片中胎生苗的產(chǎn)生，因此6-BA處理過的切割葉片產(chǎn)生的胎生苗總數(shù)是最多的。2，4-D處理的切割葉片，誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗總數(shù)比對照多。細胞分裂素和生長素都誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的胎生苗，說明在切割葉片中，這兩種激素都起到了促進胎生苗產(chǎn)生的作用。與同時用6-BA和2，4-D處理的切割葉片相比，生長素抑制劑處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗總數(shù)相對較少，說明胎生苗的長期發(fā)育過程中，兩種激素的共同作用有利于胎生苗的發(fā)育。

2.4 不同處理對胎生苗發(fā)育的影響

在0～5 d，凡是添加6-BA處理的胎生苗葉片直徑大于其他處理的。其中，同時用2，4-D和PR處理后的胎生育，葉片直徑是最小的。在6～11 d，相對于對照，單獨用6-BA處理后的胎生苗葉片直徑稍大于對照；同時用6-BA和TIBA處理的胎生苗葉片直徑稍小于對照。同時添加2，4-D和PR處理的胎生苗葉片直徑是最小的。在11～17 d，對照的胎生苗葉片直徑是最大的。6-BA、6-BA+TIBA處理的胎生苗葉片直徑大小相似，小于對照的胎生苗直徑。2，4-D+PR處理的胎生苗葉片直徑在整個發(fā)育階段一直是最小的。而且，單獨用PR處理的胎生苗葉片直徑在整個發(fā)育階段，也是一直落后于其他處理。

圖4 胎生苗在不同處理下的葉片直徑生長變化情況

3 討論

在完整葉片中，2，4-D和6-BA都表現(xiàn)出抑制胎生苗產(chǎn)生的作用，施用生長素抑制劑TIBA能略微緩解這種抑制作用，而施用細胞分裂素PR抑制劑能完全阻礙這種抑制，并能促進胎生苗的產(chǎn)生。而在切割葉片中，6-BA表型出促進胎生苗產(chǎn)生的作用，而2，4-D作用不明顯。相應(yīng)地，施用生長素抑制劑TIBA，抑制了胎生苗產(chǎn)生。特別是施用細胞分裂素抑制劑PR完全地阻止胎生苗的產(chǎn)生。不同外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗總數(shù)也與胎生苗產(chǎn)生時間呈現(xiàn)類似的趨勢。在不同的外植體中，相同濃度的兩種激素表現(xiàn)出的作用完全不同，甚至相反。某些研究認(rèn)為，由于培養(yǎng)基中的蔗糖與細胞分裂素存在拮抗作用(Kulka 2005；Hartig and Beck 2010；Rolland，Baena-Gonzalez，and Sheen 2006；Moore et al，2003)，所以高濃度的蔗糖(3%)會阻礙細胞分裂素的作用，造成實驗結(jié)果不同，但低濃度的蔗糖(0.3%)則不會對細胞分裂素產(chǎn)生拮抗作用。本實驗中，所有實驗都是在含低濃度蔗糖(0.3%)的培養(yǎng)基上進行的，而且培養(yǎng)的條件完全一致，因此，我們推測相同濃度的激素表現(xiàn)出不同作用的原因可能是由于切割葉片破壞了葉片中存儲的植物激素的平衡和運輸，也有可能是破壞了葉片中信號傳導(dǎo)途徑。

本實驗中，細胞分裂素和細胞分裂素抑制劑對完整葉片和切割葉片兩種外植體類型都相應(yīng)地產(chǎn)生明顯的抑制或者促進作用，特別是在切割葉片中，施用細胞分裂素抑制劑PR完全地抑制了胎生苗的產(chǎn)生。其他一些學(xué)者認(rèn)為細胞分裂素對胎生苗的作用可以分為兩條途徑，一條途徑，細胞分裂素直接抑制胎生苗的產(chǎn)生，使胎生苗原基保持休眠狀態(tài)。另一條途徑，細胞分裂素間接的刺激胎生苗原基的發(fā)育，這種情況在葉片出現(xiàn)傷口或者細胞分裂素運輸受阻的情況下很明顯(Kulka 2005)。這個模型類似于Ferreira和Kieber(Ferreira et al. 2007)提出的鐘形模型，根中的細胞分裂素在高濃度時抑制根的生長，在低濃度時促進根的生長。這兩個模型都能解釋細胞分裂素在完整葉片中抑制胎生苗產(chǎn)生，而在切割葉片中促進胎生苗的產(chǎn)生，而我們認(rèn)為在胎生苗的產(chǎn)生過程中，細胞分類素直接作用胎生苗原基，處于調(diào)控途徑中的下游，而生長素則處于上游。在這個過程中，推測生長素和細胞分裂素存在拮抗作用，若其中一種激素過量會使另一種激素含量降低(Moubayidin，Di，and Sabatini 2009；Fukaki and Tasaka 2009；Shimizu-Sato，Tanaka，and Mori 2009；Hwang，Sheen，and Müller 2012；Staffan et al. ；Zhi et al. 2013；SU et al.，2011)，所以生長素和生長素抑制劑處理對完整葉片中胎生苗的產(chǎn)生時間和數(shù)量影響不大。

在胎生苗發(fā)育過程中，首先起作用的激素也是細胞分裂素，6-BA處理的胎生苗葉片直徑明顯大于其他處理。而細胞分裂素抑制劑處理的胎生苗，葉片直徑一直都是所有處理中較小的。接著，激素的作用逐漸減小，對照中的胎生苗直徑相對是最大的。所以，在胎生苗的發(fā)育過程中激素的作用不是一成不變的，6-BA在胎生苗發(fā)育前期刺激其生長，但是在后期作用逐漸減小。雖然，細胞分裂素在胎生苗的產(chǎn)生和發(fā)育過程中起到了主要作用，但是仍然不能忽略生長素的作用。在胎生苗總數(shù)中，2，4-D處理的總數(shù)在統(tǒng)計后期都不同于前期，說明在胎生苗發(fā)育的后期生長素的作用逐漸重要。

作者貢獻

劉華是本研究的實驗設(shè)計者和實驗研究的執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)分析，論文初稿的寫作，參與實驗設(shè)計和試驗結(jié)果分析；鐘天秀是項目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終的文本。

致謝

本研究由國家自然基金(31802116)和貴州省科技計劃項目(LH[2017]7027)共同資助。參與本研究的全體人員向資助方表示衷心感謝。