梁 珍，李林輝

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637002)

氮素是土壤中利于植物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)元素之一，氮素缺乏將會(huì)導(dǎo)致植物葉綠素、蛋白質(zhì)、酶等化合物合成減少，抑制光合作用并影響植物生長(zhǎng)[1]。土壤中可利用的氮素十分有限，不能最大限度滿足作物的高產(chǎn)需求。施用化學(xué)氮肥是目前提高土壤含氮量最普遍的方法，但其過(guò)多的施用會(huì)導(dǎo)致地下及地表水污染，破壞河流生態(tài)環(huán)境，還會(huì)使得土壤酸化，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分大量流失，除此之外還會(huì)通過(guò)反硝化作用增加N2O的量，加劇溫室效應(yīng)[2]。與施用化學(xué)氮肥相比，生物固氮的安全性及有效性更高，有利于土壤的安全性及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。目前生物固氮微生物類群很多，除了根瘤菌依賴于豆科作物外[4]，其他固氮菌的固氮能力嚴(yán)重依賴于環(huán)境條件，環(huán)境不適宜時(shí)，很難有預(yù)期的效果。然而動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，如果有固氮能力，效果是可預(yù)期的。蚯蚓作為“土壤生態(tài)系統(tǒng)工程師”，不僅對(duì)土壤生物修復(fù)及物質(zhì)循環(huán)有重要作用，其腸道獨(dú)特的厭氧狀態(tài)和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也為厭氧和兼性厭氧菌提供了有利的微環(huán)境。有研究報(bào)道蚯蚓腸道內(nèi)含有固氮菌[5]，但對(duì)其種類、固氮效果等鮮有報(bào)道。因此研究蚯蚓腸道固氮菌，對(duì)蚯蚓腸道內(nèi)固氮微生物的開(kāi)發(fā)與利用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 蚯蚓來(lái)源 采集自西華師范大學(xué)校園。

1.1.2 培養(yǎng)基Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基參考《一株固氮菌的篩選、鑒定及混菌發(fā)酵制備復(fù)合型菌糠菌肥的研究》[6]。

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓腸道固氮菌的分離 參考李森楠等人的操作方法[7]。略有改動(dòng)，獲得蚯蚓腸道內(nèi)容物后將其接種于Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，挑取生長(zhǎng)最旺盛的單菌落繼續(xù)純化培養(yǎng)，共轉(zhuǎn)接四次，最終獲得一株純化菌株，將其命名為006。

1.2.2 固氮菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：在培養(yǎng)基中觀察菌株菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察菌株菌體形態(tài)。

生理生化鑒定：對(duì)分離出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)，接觸酶實(shí)驗(yàn)，甲基紅試驗(yàn)，含碳化合物(甘露醇，鼠李糖，麥芽糖，半乳糖)的利用試驗(yàn)，明膠液化實(shí)驗(yàn)，淀粉水解實(shí)驗(yàn)，葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，纖維素分解實(shí)驗(yàn)[8]。

分子鑒定：提取分離菌株006全基因組DNA，以其為模板，用引物27F(5-’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)擴(kuò)增16SrDNA，用引物P1(5’-GGCTGCGATCCVAAGGCCGAYTCVACCCG-3‘)和P2(5’-CTGVGCCTTGTTYTCGCGGATSGGCATGGC-3’)擴(kuò)增固氮酶nifH基因[9]。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

固氮酶基因nifH檢測(cè)：將引物P1、P2擴(kuò)增到的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)。

固氮菌16SrDNA 片段序列分子系統(tǒng)學(xué)分析：將引物27F、1492R擴(kuò)增到的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，并選取相似度高的菌株以及同一菌群內(nèi)知名度高的菌株作為參考菌株，用 MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育建樹(shù)，其分析方法采用鄰接法(NJ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌的經(jīng)典鑒定

形態(tài)學(xué)特征：細(xì)菌006在Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形、白色、半透明、光滑、濕潤(rùn)、易挑取，光學(xué)顯微鏡下菌體呈短桿狀，單個(gè)排列。

生理生化特性分析：見(jiàn)表1。

表1 生理生化特征分析

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]，初步鑒定該菌屬于克雷伯氏菌屬。

2.2 nifH基因檢測(cè)

以細(xì)菌006總DNA為模板，擴(kuò)增nifh基因，擴(kuò)增出大約300bp的片段，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該片段序列與Klebsiella sp. TD153S 固氮酶還原酶基因(nifH)相似性達(dá)100%，可以確定該菌含固氮酶nifH基因，該菌屬于固氮菌。

2.3 固氮菌16SrDNA 片段序列分子系統(tǒng)學(xué)分析

用引物擴(kuò)增固氮菌006 16SrDNA序列，擴(kuò)增出1300bp左右的片段，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與Klebsiella variicola(NR_025635.1)親緣關(guān)系最近，其相似性為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析及生理生化特征分析， 將該固氮菌鑒定為變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。用 MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示。

圖1 固氮菌16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

蚯蚓作為生態(tài)系統(tǒng)中的分解者及消費(fèi)者，與土壤密切相關(guān)，土壤為蚯蚓提供棲息地，而蚯蚓的日?；顒?dòng)改善土壤的結(jié)構(gòu)、滲透性、能量流動(dòng)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化[10]。蚯蚓腸道菌在維持蚯蚓的新陳代謝、對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和污染物的轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。Biswas等人從蚯蚓腸道中分離出的巨大芽孢桿菌菌株、地衣芽孢桿菌菌株和溶血葡萄球菌菌株能通過(guò)使重金屬離子和磷酸鹽形成復(fù)合物來(lái)降低Cu2+和Zn2+的毒性[11]。Huerta等人則發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道內(nèi)含有可分解微塑料的細(xì)菌，如厚壁菌門細(xì)菌、芽孢桿菌和放線菌，它們通過(guò)將微塑料當(dāng)做碳源來(lái)代謝低密度聚乙烯、聚丙烯和聚氯乙烯[12]，從而對(duì)微塑料污染物進(jìn)行降解。而本文從校園土壤蚯蚓腸道中獲得的固氮菌——變棲克雷伯氏菌，歸屬于變形菌門克雷伯氏菌屬，兼性厭氧，具有固氮作用。該類細(xì)菌屬于聯(lián)合固氮菌，不僅在固氮方面發(fā)揮重要作用，在溶磷、解鉀、生物防治、作為鐵載體及環(huán)境污染物降解等方面都有重要作用[13]，并被廣泛應(yīng)用于甘蔗[14]、禾麥苗[15]的聯(lián)合固氮中。此前也有從環(huán)境中分離得到變棲克雷伯氏菌[16]的例子，但環(huán)境的不穩(wěn)定會(huì)對(duì)細(xì)菌的活力和聯(lián)合固氮力有影響。本文的固氮菌是從蚯蚓腸道中分離得到的，我們驗(yàn)證了它的固氮能力并確定了它的分類學(xué)地位，為以后將固氮菌回植到蚯蚓腸道中，使其發(fā)揮穩(wěn)定的固氮能力打下了基礎(chǔ)。今后我們還需進(jìn)一步探索變棲克雷伯氏菌的固氮能力以及將其回植到蚯蚓腸道內(nèi)的可行性、最佳接種量、最佳接種條件等。