閔筱輝?覃延翔?黎潔瑤?陳其奎?蕭煥明?許稷豪

【摘要】目的 探討四君子湯改善肝硬化病理改變的作用，并且研究四君子湯對(duì)肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變情況，探索潛在的分子作用機(jī)制。方法 采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生肝硬化，并用標(biāo)準(zhǔn)劑量的四君子湯灌胃治療肝硬化大鼠12周，通過肝組織HE染色、Masson染色，從病理學(xué)改變?cè)u(píng)估四君子湯治療肝硬化效果。隨后采取Illumnia高通量測(cè)序，同步對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果篩選差異表達(dá)基因（DEG），并進(jìn)行生物聚類分析、KEGG信號(hào)通路聚類分析。結(jié)果 與正常SD大鼠相比，CCl4誘導(dǎo)的肝硬化SD大鼠肝組織出現(xiàn)廣泛的假小葉，轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序共篩選出402個(gè)DEG。GO富集分析發(fā)現(xiàn)DEG主要富集于細(xì)胞周期相關(guān)生物學(xué)功能。KEGG分析提示DEG明顯富集于細(xì)胞增殖、分化通路。CCl4誘導(dǎo)肝硬化大鼠在經(jīng)過四君子湯治療后，肝臟組織中的假小葉明顯減少，共有411個(gè)DEG。GO以及KEGG分析提示DEG分別富集于細(xì)胞周期生物學(xué)功能以及細(xì)胞增殖、腫瘤相關(guān)信號(hào)通路。結(jié)論 四君子湯可有效緩解CCl4所誘導(dǎo)的肝硬化，其中細(xì)胞增殖相關(guān)Wnt通路受到明顯調(diào)控，可能是四君子湯治療肝硬化的分子機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】肝硬化;四君子湯;轉(zhuǎn)錄組學(xué);細(xì)胞增殖

Mechanism of Sijunzi decoction in treatment of liver cirrhosis based on? transcriptomic sequencing

Min Xiaohui， Qin Yanxiang， Li Jieyao， Chen Qikui， Xiao Huanming， Xu Jihao.Department of Gastroenterology， Sun Yat-sen Memorial hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Xu Jihao， E-mail： xujh66@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To investigate the effect and molecular mechanism of Sijunzi decoction on the pathological changes of CCl4-induced liver cirrhosis （LC） and evaluate the role of Sijunzi decoction in the transcriptomic changes of liver cells. Methods SD rats were treated with CCl4 to induce LC and given with standard dose of Sijunzi decoction for 12 weeks by gavage. The efficacy of Sijunzi decoction in the treatment of LC was assessed according to pathological changes by HE and Masson staining. The deferentially-expressed genes （DEGs） in CCl4-induced LC rats were identified using Illumina Hiseq sequencing system. The gene ontology （GO） and pathway enrichment analyses were performed in the DAVID and KEGG pathway databases， respectively. Results Compared with the SD wild-type rats， CCl4-induced LC rats presented with multiple liver fibrous septa and cirrhotic nodules. The treatment of Sijunzi decoction significantly reduced liver fiber interval and degeneration degree in CCl4-induced LC rats. A total of 402 DEGs were identified between the wild-type and CCl4-induced LC rats. GO enrichment analysis demonstrated that the DEGs were mainly enriched in cell cycle-associated biological function. The KEGG pathway enrichment analysis revealed that the DEGs were significantly associated with cell proliferation- and cell division-associated signaling pathways. Similarly， Sijunzi decoction treatment led to 411 DEGs in the liver of LC rats. GO and KEGG analyses revealed that those DEGs were significantly enriched in the cell cycle process and cell proliferation- and tumor-associated signaling pathways， respectively. Conclusion Sijunzi decoction effectively attenuates CCl4-induced LC in rat models by regulating the cell proliferation-associated Wnt signaling pathway， which is probably the underlying mechanism.

【Key words】Liver cirrhosis; Sijunzi decoction; Transcripnomic analysis; Cell proliferation

肝硬化是由一種或多種病因長(zhǎng)期或反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害，主要病因?yàn)椴《拘愿窝?、酒精中毒及營養(yǎng)障礙等。病理改變?yōu)楦渭?xì)胞廣泛壞死、殘存肝細(xì)胞代償性再生形成結(jié)節(jié)、結(jié)締組織增生與纖維隔形成，進(jìn)一步破壞肝小葉結(jié)構(gòu)，形成假小葉。肝臟逐步變形、變硬，最終形成肝硬化[1-2]。肝硬化可引起多個(gè)并發(fā)癥，譬如門靜脈高壓、門靜脈血栓、肝性腦病、肝肺綜合征及肝腎綜合征等[3-5]。肝硬化作為全球第14大死因，每年導(dǎo)致120萬人死亡，儼然已成為嚴(yán)重威脅全球的公共健康問題[6]。四君子湯是一種傳統(tǒng)的中藥制劑，由人參、茯苓、白術(shù)、甘草炮制而成[7]。在祖國醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐中，四君子湯主要用于治療慢性胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性腹瀉、急慢性肝損傷、腸麻痹及習(xí)慣性便秘等諸多消化道疾病[8-10]。有文獻(xiàn)報(bào)道四君子湯可有效改善肝臟切除術(shù)后的肝功能和免疫功能，減輕肝纖維化水平[11]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)四君子湯的應(yīng)用可以明顯減少大鼠肝臟缺血-再灌注損傷時(shí)肝細(xì)胞凋亡[12]。上述研究提示四君子湯具有潛在抗肝纖維化、修復(fù)肝細(xì)胞作用，然而目前仍未有研究分析四君子湯對(duì)肝硬化的治療效果及作用機(jī)制，因此本研究旨在探索四君子湯對(duì)肝硬化的治療作用及其潛在的分子生物學(xué)機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑和動(dòng)物

純四氯化碳（CCl4）、純橄欖油購自武漢化學(xué)試劑公司，制成10%CCl4橄欖油溶液;制備四君子湯的所有中草藥原材料均來自湖北天脊中草藥切片有限公司，將所有原料（人參、茯苓、白術(shù)、甘草，配制比例9∶9∶9∶6）放入陶瓷鍋中，用1500 mL純水浸泡30 mim，大火煮沸后，文火熬制30 mim，隨后用雙層紗布過濾湯劑。過濾后的湯劑濃縮成1.0 g/mL，儲(chǔ)存在4 ℃環(huán)境，使用時(shí)在40 ℃后加熱[13]。SD雄性大鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購入，共16只，6周齡。大鼠飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)環(huán)境維持于（23±3）℃，每12 h晝夜明暗交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格遵守中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理準(zhǔn)則。

二、肝硬化大鼠模型的建立和四君子湯干預(yù)

將16只健康雄性 SD大鼠按編號(hào)隨機(jī)分為H1組（空白對(duì)照組，n = 4） 、H2組（干預(yù)對(duì)照組，n = 4） 、H3組（干預(yù)模型組，n = 4）和H4組（空白模型組，n = 4）。采用腹腔注射10% CCl4誘導(dǎo)肝硬化大鼠模型[14]。H3和H4組大鼠腹腔注射10% CCl4橄欖油溶液，給藥劑量為1 g/μL，每周3次;H2、H4組在腹腔注射后，給予四君子湯[1.5 g /100 （g·d） ]灌胃干預(yù)。H1、H2組大鼠腹腔注射等劑量橄欖油溶液后，給予生理鹽水灌胃對(duì)照。CCl4造模、四君子湯干預(yù)持續(xù)12周。

三、肝組織病理染色

在干預(yù)終點(diǎn)，對(duì)各組大鼠實(shí)施頸椎脫臼法處死。本研究采用肝硬化疾病評(píng)分模型 （ SLCD，結(jié)果記為R值）及拉埃內(nèi)克纖維化評(píng)分系統(tǒng) （LFSS，LFSS評(píng)分中0期為正常肝組織、1 ～ 3期為纖維化期、4A ～ 4C為肝硬化期，L為4B期，可見纖維隔明顯增寬、增多，假小葉的數(shù)量增加，提示肝硬化造模成功）評(píng)估小鼠肝硬化造模效果[15-17]。R值計(jì)算公式如下（式中W、T、A、P、I、C分別代表大鼠年齡、血清總膽紅素、血清清蛋白、血清前清蛋白、凝血酶原時(shí)間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值、血清肌酐）：

R = 0.16×（20 - W）/10+0.24×（17.06 - T）/

16.44 + 0.2×（A - 10.33）/11.95 + 0.14×（P - 2.93）/

11.63 + 0.14×（0.92 - I）/0.16 + 0.12×（32.11 - C）/

11 - 61

R = 1表示肝組織正常，0.702≤R < 1表示肝臟炎癥反應(yīng)和局灶性變性、壞死，0.542≤R < 0.702表示肝組織纖維增生，0.352≤R < 0.542表示肝臟假小葉形成，屬于肝硬化期，R < 0.352表示肝硬化后期。

沿正中線剪開腹腔，充分暴露腹腔后用真空采血管于下腔靜脈采血，標(biāo)本離心后取上清液上機(jī)檢測(cè)總膽紅素、清蛋白、前清蛋白、凝血酶原時(shí)間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值、血清肌酐等，然后將左葉肝組織剪取下，并浸泡于甲醛固定液，按標(biāo)準(zhǔn)步驟制作成石蠟切片。對(duì)肝組織進(jìn)行HE染色。為了分析肝纖維化區(qū)域的網(wǎng)狀纖維，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行Masson染色[18]。用HE以及Masson染色法，比較各組間的差異。在顯微鏡下（×400）進(jìn)行肝組織病理觀察，肝小葉的廣泛形成代表肝硬化造模成功。

四、轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序

轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序的流程主要包括：樣品檢測(cè)、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)量檢測(cè)、上機(jī)測(cè)序等部分，用 Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)（HiSeq/MiSeq）進(jìn)行雙末端測(cè)序。隨后按照以下流程進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)處理：原始測(cè)序數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估及數(shù)據(jù)過濾，參考序列/基因組比對(duì)分析，轉(zhuǎn)錄本組裝。

五、測(cè)序數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEG）分析，主要包括GO富集分析及KEGG富集分析。分別對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行聚類分析，根據(jù)默認(rèn)參數(shù)來檢索GO和信號(hào)通路富集分析[19]。結(jié)果只顯示生物過程類別和信號(hào)通路中富集程度最高的10個(gè)聚類。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以? 表示，多組間樣本比較用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后，用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較。P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、肝硬化造模成功

HE染色提示，H1、H2組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，未見變性或壞死細(xì)胞，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，見圖1A、B。LSD-t分析提示，H1與H2組R值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間R值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均 < 0.05），見表1。H3組大鼠經(jīng)過CCl4誘導(dǎo)后，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生，假小葉形成，SLCD評(píng)分R = 0.457±0.010。提示肝硬化造模成功，同時(shí)肝細(xì)胞大量脂肪變性、壞死、纖維間隔形成，肝細(xì)胞增生明顯，間質(zhì)內(nèi)彌漫性炎細(xì)胞浸潤，見圖1C。H4組經(jīng)過四君子湯治療12周后，大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)因纖維組織分割而紊亂，原肝小葉沒有被完全分割，假小葉數(shù)量較H3組減少，肝細(xì)胞形態(tài)與H1組相似（圖1D）。

二、四君子湯對(duì)肝硬化的治療效果

Masson 染色顯示，H1、H2組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見纖維組織增生（圖1E、F）。CCl4維持誘導(dǎo)下，H3組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯，纖維組織大量增生，并破壞小葉界板，廣泛形成假小葉，纖維隔顯著增寬;經(jīng)過四君子湯治療后，H4組大鼠受CCl4誘導(dǎo)破壞的肝小葉、纖維化范圍減少，假小葉數(shù)量下降（圖1G、H）。

三、四君子湯干預(yù)后轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

根據(jù)FDR≤0.05且|log2FC|≥1作為DEG的篩選條件，結(jié)果以火山圖進(jìn)行展現(xiàn)。在CCl4誘導(dǎo)的肝硬化模型中，共有402個(gè)DEG，其中有284個(gè)上調(diào)，118個(gè)下調(diào)（H1 vs. H3，圖2A）。通過H4與H3組的對(duì)比，分析四君子湯干預(yù)肝硬化的作用，共篩選出411個(gè)DEG，其中292個(gè)上調(diào)，119個(gè)下調(diào)（圖2B）。

依據(jù)4組的基因表達(dá)情況，并按照DEG的篩選條件制作4組DEG表達(dá)熱點(diǎn)圖（圖3）。熱點(diǎn)圖提示共有15個(gè)DEG在H3組明顯高表達(dá);Rgs16、Ac094053以及Cpne4均在H1組呈現(xiàn)特異性高表達(dá);對(duì)比于H1、H3組，Bmp4、Ihh、Rtp3和Lpar6 4個(gè)基因均在H2與H4組呈現(xiàn)高表達(dá)。

四、DEG聚類分析

對(duì)上述DEG進(jìn)行GO聚類注釋、分類以及統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，肝硬化病變過程中，DEG在生物過程分類里顯著富集于細(xì)胞周期及細(xì)胞分化相關(guān)功能;在分子功能分組上，細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、蛋白激酶活性及結(jié)合、微管結(jié)合是顯著富集的類型;在細(xì)胞組分分組上，微管、細(xì)胞骨架、微小染色體維持復(fù)合體是顯著富集的類型，見圖4。

肝硬化大鼠在接受四君子湯干預(yù)后，肝組織所產(chǎn)生的DEG，同樣也主要富集于細(xì)胞周期等相關(guān)聚類;而在分子功能聚類中，DEG顯著富集在Wnt蛋白結(jié)合、核受體活性及蛋白激酶結(jié)合等功能。在細(xì)胞組分聚類上，微管、細(xì)胞骨架及細(xì)胞連接是顯著富集類型，見圖4。

五、KEGG信號(hào)通路顯著富集分析

同樣地，本研究對(duì)上述篩選所得出的DEG進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，選取富集程度最高的前30個(gè)信號(hào)通路。結(jié)果顯示，CCl4誘導(dǎo)肝硬化 大鼠的肝組織中，DEG主要富集在Wnt、p53、Hippo等細(xì)胞增殖、腫瘤相關(guān)通路（圖5A）。相類似地，四君子湯干預(yù)后，肝硬化大鼠肝組織中的DEG顯著聚集于Wnt、p53以及Hippo等細(xì)胞增殖、腫瘤相關(guān)信號(hào)通路（圖5B）。

討 論

肝硬化是由于病毒感染、自身免疫異常、藥物等因素，造成肝細(xì)胞不可逆地破壞，進(jìn)一步導(dǎo)致肝內(nèi)假小葉的形成，肝硬化及其并發(fā)癥對(duì)患者的生活質(zhì)量、生存預(yù)后的嚴(yán)重影響[20-22]?；谖覈嫶蟮母斡不颊呷后w基數(shù)，尋求合理有效的治療方法改善患者預(yù)后是目前極為迫切的需求。四君子湯作為傳統(tǒng)的中藥復(fù)方制劑，在臨床實(shí)踐中被應(yīng)用于多種消化道疾病治療，也有報(bào)道四君子湯可能對(duì)肝硬化有潛在的治療作用，但是目前尚未有明確的研究驗(yàn)證四君子湯對(duì)肝硬化的療效，以及其中的分子機(jī)制[23-25]。本研究者發(fā)現(xiàn)，在CCl4的作用下，大鼠肝臟組織廣泛出現(xiàn)了典型的肝小葉;而四君子湯能有效減少CCl4誘導(dǎo)的肝假小葉數(shù)量，提示四君子湯對(duì)肝硬化具有潛在的治療作用。同時(shí)運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析探索四君子湯改善肝硬化的分子生物學(xué)機(jī)制。

CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序得到的DEG，經(jīng)過GO聚類分析，證實(shí)DEG聚集于細(xì)胞周期相關(guān)生物過程、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、蛋白激酶活性及結(jié)合、微管結(jié)合等分子功能分組上、微管、細(xì)胞骨架、微小染色體維持復(fù)合體等細(xì)胞組分。GO聚類下3個(gè)組分的主要分類主要與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖相關(guān)聯(lián)，細(xì)胞周期的有序進(jìn)行，促進(jìn)遺傳物質(zhì)復(fù)制、細(xì)胞更新以及增殖，肝細(xì)胞再生即是在細(xì)胞增殖調(diào)控因子的作用下，肝細(xì)胞進(jìn)行增殖、分化[26]。大鼠肝硬化病理進(jìn)展中，有關(guān)細(xì)胞周期相關(guān)功能的基因差異化表達(dá)，提示肝細(xì)胞在上游調(diào)控機(jī)制作用下，產(chǎn)生增殖、更新功能異常。四君子湯干預(yù)作用下，肝細(xì)胞的DEG生物學(xué)功能聚類主要聚集在細(xì)胞周期、分化功能。這一結(jié)果提示，四君子湯可調(diào)節(jié)、修復(fù)CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞周期、增殖功能異常，從而產(chǎn)生肝硬化治療作用。

既往研究提示p53、Hippo、Wnt等細(xì)胞增殖、腫瘤相關(guān)信號(hào)通路參與肝纖維化的分子調(diào)控機(jī)制[27-29]。類似地，本研究通過KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)CCl4誘導(dǎo)肝硬化大鼠的肝組織中，Wnt、p53、Hippo多個(gè)基因產(chǎn)生差異化表達(dá)。四君子湯的干預(yù)，Wnt、p53、Hippo信號(hào)通路活性產(chǎn)生明顯改變，肝纖維化得到有效的改善。提示四君子湯對(duì)這些經(jīng)典的細(xì)胞增殖通路有重要的調(diào)控作用。其中，GO分子功能組分分析顯示四君子湯干預(yù)可影響Wnt蛋白結(jié)合，因此，Wnt可能為四君子湯抗肝纖維化、調(diào)節(jié)肝細(xì)胞異常增殖、分化的重要靶點(diǎn)。Wnt通路在細(xì)胞作為經(jīng)典的細(xì)胞增殖通路，在維持細(xì)胞的正常增殖有著重要作用，通路活性的改變可促進(jìn)肝細(xì)胞異常增殖進(jìn)一步誘發(fā)腫瘤形成[30-32]。

新近研究證實(shí)Wnt信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)CCN4顯著上調(diào)肝纖維化標(biāo)志物的表達(dá)，從而促進(jìn)肝硬化的病理進(jìn)展，靶向調(diào)節(jié)Wnt通路可能是抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)[33-34]。本研究結(jié)果顯示CCl4誘導(dǎo)的肝硬化組織中Wnt通路多個(gè)基因產(chǎn)生差異化表達(dá)，而在四君子湯治療后，Wnt通路受到調(diào)控，多個(gè)DEG顯著聚集于Wnt通路，提示W(wǎng)nt可能在肝硬化病變中起著重要調(diào)控作用，而四君子湯改善肝組織纖維化的過程，顯著調(diào)節(jié)Wnt通路活性，提示W(wǎng)nt通路可能是四君子湯治療肝硬化的潛在分子生物學(xué)機(jī)制。

綜上所述，本研究四君子湯對(duì)肝硬化大鼠模型干預(yù)，證實(shí)四君子湯可有效緩解肝硬化進(jìn)程，可能是作用于Wnt等細(xì)胞增殖相關(guān)通路，進(jìn)而調(diào)控肝細(xì)胞周期、增殖功能，發(fā)揮延緩、改善肝纖維化的作用。該發(fā)現(xiàn)可能為四君子湯治療肝硬化發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)、理論基礎(chǔ)和個(gè)體化靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研發(fā)傳統(tǒng)中醫(yī)藥制劑精確化治療肝硬化提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-06-15）

（本文編輯：楊江瑜）