唐祿 董麗平 尹茉莉 劉磊 董媛 王會巖

（1. 吉林醫(yī)藥學院，吉林 132013；2. 吉林省抗體工程科技協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林 132013）

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是一類能促進成纖維細胞生長的蛋白質，目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的FGF家族共有23個成員［1］，分子量為17 kD-34 kD，成員之間的氨基酸序列同源性較高，多數(shù)成員來自中胚層和神經(jīng)外胚層細胞［2］。廣泛存在于人和動物體內(nèi)，參與多種器官發(fā)育、血管新生、促有絲分裂、細胞遷移和分化等，現(xiàn)已廣泛應用于組織創(chuàng)傷修復，美容創(chuàng)面修復、皮膚早衰等領域［3］。FGF20是FGF家族中的一員，與FGF9和FGF16屬于同一亞家族［4］。2000年首次被Ohmachi等［5］發(fā)現(xiàn)，同年 Kirikoshi等［6］在人體中發(fā)現(xiàn)了FGF20，其成熟蛋白質由211個氨基酸組成，二級結構存在大量的β折疊。成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth gactor recepter，F(xiàn)GFR）屬于酪氨酸激酶受體的一種［7-8］，F(xiàn)GF20通過與FGFR特異結合，啟動相應的信號轉導，從而發(fā)揮其生物學功能。FGF20在退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］、形態(tài)發(fā)生［10］、毛囊生長［11-12］、組織修復［13］等過程中發(fā)揮著重要作用。另外，F(xiàn)GF20的多態(tài)性還是中國漢族人群的PD 疾病的危險因素［14］。Jeffers等［15］利用實時定量PCR技術檢測不同人腫瘤細胞中FGF20 mRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)在肺癌、胃癌及結腸癌細胞中FGF20基因表達量最高，在正常組織中則是低表達；劉萍等［16-17］利用免疫組化檢測結果顯示，F(xiàn)GF20在大腸癌組織中異常表達，隨后通過免疫組化和Western Blot檢測，顯示直腸癌中FGF20表達顯著高于正常腸粘膜組織，且FGF20表達與結直腸癌組織的浸潤及淋巴結轉移顯著相關。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF20基因定位的8號染色體區(qū)域，發(fā)生突變后容易產(chǎn)生神經(jīng)退行性疾病，胃癌和肺癌等疾?。?8-19］。Fitzmaurice等［20］調查發(fā)現(xiàn)，2018年，全球共有2 450萬癌癥病例，導致了960萬人死亡。我國2014年確診的惡性腫瘤病例數(shù)為380.4萬例，2019年約為392.2萬例，增長率為3.2%。而肺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌為最為常見的癌癥，如果患者能在患病的早期就及時發(fā)現(xiàn)顯得尤為重要。由于FGF20可在肺癌、胃癌及結腸癌細胞中過表達，可作為幾種癌癥潛在的腫瘤標志物，因此制備抗FGF20的高親和力抗體，可以為肺癌和其他癌癥早期診斷篩查及預后評估提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠骨髓瘤細胞株（SP2/0）為本實驗室保存。大腸桿菌BL21（DE3）plysS購于北京全式金生物，載體由上海杰瑞生物工程公司合成構建。Balb/c小鼠購于長春生物制品研究所。

蛋白胨、酵母提取物購于英國OXOID公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗體購于美國Abmart公司；商品化FGF20購于上海優(yōu)寧維；亞型抗體檢測試劑盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT購于美國sigma公司；胎牛血清購于美國BI公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；SUMO酶（本實驗室保存）；超濾管購于Millipore公司；25 cm2細胞培養(yǎng)瓶、75 cm2細胞培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板購于美國Corning公司；純化填料和層析柱購于美國GE公司；Tris堿、NaCl等試劑均為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 pET24a-SUMO-hFGF20表達載體的構建 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫FGF20基因（ID：26281）序列的5′端添加SUMO基因序列，并在序列兩側設計Nde I、BamH I酶切位點，優(yōu)化并合成基因序列。公司合成載體（由上海杰瑞完成）。重組質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）plysS感受態(tài)細胞中。涂布于含Kana+的LB平皿，37℃倒置培養(yǎng)12-16 h。

1.2.2 抗原的表達 從平皿中挑取單菌落，接種于 5 mL LB 培 養(yǎng) 基 中（Kana+，10 μg/mL），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至A600達到0.8-1.0左右時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導目的蛋白表達，20℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，4℃、9 000 r/min離心15 min收集菌體。按照菌體∶裂解液（20 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA-2Na pH 8.2）1∶10的比例，重懸菌體超聲破碎，功率為50%，工作4 s，間休6 s，超聲30 min。離心收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析蛋白表達情況。

1.2.3 抗原的純化 大量制備菌體，加入裂解液溶解后，在低溫條件下用高壓均質機破碎菌體。4℃、20 000 r/min，離心 30 min，收集上清，0.45 μm濾膜過濾，上清液先用鎳NTA親和層析柱純化，收集洗脫液，PBS溶液透析過夜，然后采用SUMO酶進行酶切。4℃條件下酶切16 h。酶切后樣品再次經(jīng)鎳NTA親和層析柱純化，收集流出液，用超濾管（截流分子量10 kD）超濾置換溶液。收集的蛋白溶液純度采用SDS-PAGE法檢測，濃度用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定。

1.2.4 動物免疫 選擇7-8周齡雌性Balb/c小鼠3只（20±2）g，將FGF20蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合乳化，通過頸背部多點皮下注射進行首次免疫（100 μg/只小鼠）。兩周后進行第2次免疫，F(xiàn)GF20蛋白與弗氏不完全佐劑（劑量與首次相同）乳化后頸背部多點注射。3次免疫后，小鼠尾靜脈收集血清，用間接ELISA檢測血清中抗體效價。選取一只最佳免疫的小鼠，融合前3 d腹腔注射抗原作加強免疫（劑量同前）。本實驗已通過吉林醫(yī)藥學院動物倫理委員會審查（編號：2021-LW004）。

1.2.5 雜交瘤細胞的建立與篩選 首先制備飼養(yǎng)層細胞，取1只未免疫的Balb/c小鼠，處死后置于75%乙醇溶液中浸泡5 min，在超凈工作臺內(nèi)操作暴露腹膜。用預熱RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗腹腔并收集沖洗液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)，將濃度調至1×105個/mL，每孔100 μL，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜。取對數(shù)生長期SP2/0細胞，離心重懸后細胞計數(shù)。另取血清效價最高的BALB/c小鼠，脫頸處死后75%乙醇浸泡5 min，取脾臟研磨，200目濾網(wǎng)過濾，收集脾細胞。脾細胞和SP2/0細胞以2∶1的比例混合，離心棄上清，滴入50%的PEG溶液 1 mL，靜置45 s后，加入RPMI-1640細胞培養(yǎng)液終止PEG作用。用含10%胎牛血清和HAT的RPMI-1640細胞選擇培養(yǎng)液重懸，96孔板中每孔200 μL，37℃，5% CO2培養(yǎng)。待細胞融合后，第4天更換培養(yǎng)液，第7天篩選融合細胞（取細胞上清，采用間接ELISA法篩選融合細胞），用酶標儀在450 nm測定吸收值，陽性/陰性值（P/N）大于2.1作為陽性細胞。通過有限稀釋法進行3-4次亞克隆。

1.2.6 單克隆抗體的純化 取3只適齡的Balb/c小鼠，預先腹腔注射0.5 mL石蠟制敏小鼠，1周后腹腔注射雜交瘤細胞（2×106個/0.5 mL），觀察腹水產(chǎn)生情況，10 d后收集腹水。4℃，12 000 r/min，離心30 min，收集上清，0.45 μm濾膜過濾，4℃保存待用。收集的腹水樣品先用等體積的10 mmol/L PBS（pH 7.4±0.2）溶液稀釋，protein G親和層析柱純化，先用10 mmol/L PBS（pH 7.4±0.2）預平衡層析柱10個柱體積，然后上稀釋后腹水樣品，上樣結束后再用PBS溶液平衡至基線穩(wěn)定。用0.1 mol/L甘氨酸溶液（pH 3.0）洗脫，收集樣品，離心管中預先加入1 mol/L Tris溶液（pH 9.0），收集的蛋白樣品用超濾管（截留分子量10 kD）進行濃縮換液。收集的蛋白溶液純度采用SDS-PAGE法檢測。

1.2.7 單克隆抗體的分析檢測

1.2.7.1 ELISA法測定抗體效價 將純化的FGF20蛋白包被 ELISA 板（5 μg/mL，100 μL/孔），4℃孵育過夜，洗滌液洗板3次，用封閉液稀釋待測抗體，加入到ELISA板中100 μL/孔，稀釋倍數(shù)分別為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800，100 μL/孔，37℃孵育 40 min，洗滌液洗板3次，再加入山羊抗鼠IgG-HRP二抗（稀釋比例為1∶8 000）100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗滌液洗板3次；加TMB顯色液100 μL/孔，室溫避光孵育3-10 min，每孔加50 μL終止液終止反應，用酶標儀在450 nm下檢測每孔吸收值。

1.2.7.2 抗體亞型分析 按照sigma鼠單克隆抗體亞型檢測試劑盒使用說明書，檢測純化后的抗體，鑒定單克隆抗體的亞型，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.7.3 Western Blotting檢測 配制12%的SDSPAGE膠，將等量純化FGF20蛋白與商品化FGF20上樣進行電泳，電泳結束后，將目的蛋白轉印到PVDF膜上（恒流300 mA，1 h），然后用封閉液（含5%脫脂奶粉+TBST）溶液室溫封閉PVDF膜1-2 h，加入封閉液稀釋后的純化抗體（1∶5 000稀釋），4℃孵育過夜，第2天用TBST溶液洗滌PVDF膜3次后，加入用TBST溶液稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgGHRP二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h后，TBST溶液洗滌3次，最后用ECL曝光液曝光。用伯樂ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。

1.2.7.4 Surface Plasmon Resonance（SPR）測定抗體親和力 SPR實驗使用BIAcore T200儀器，在HBSEP緩沖液（10 mmol/L HEPES、150 mmol/L NaCl、3 mmol/L EDTA、0.005%聚山梨醇酯20，pH 7.4）中進行。通過胺偶聯(lián)反應將FGF20蛋白固定在CM5芯片上，使其保持充分的配體結合能力。采用控制流通道作為基準面進行體效應的減法。增加濃度的抗體注射對固定化和參考通道，然后用再生液（2 mol/L NaCl，10 mmol/L醋酸鈉，pH 4.5）處理芯片。最后用BIA Evaluation軟件對數(shù)據(jù)進行評估，根據(jù)擬合的飽和結合曲線計算平衡離解常數(shù)Kd。

2 結果

2.1 重組蛋白的誘導表達和純化

構建的重組質粒經(jīng)Nde I、BamH I雙酶切后，DNA電泳結果顯示（圖1），在1 000 bp附近處有一條明顯的條帶，與預計大小相符。工程菌pET24a-SUMO-hFGF20經(jīng)過IPTG誘導后，SDS-PAGE結果顯示，在相對分子量為37 kD出現(xiàn)一條明顯的條帶，與預期結果一致，顯示目的蛋白在上清中表達（圖2）。均質破碎后離心樣品通過鎳NTA親和層析柱，捕獲到SUMO-FGF20融合蛋白，按比例用SUMO酶酶切后，樣品再經(jīng)過鎳NTA親和層析柱，收集穿出液即獲得目的蛋白（圖3）。

圖1 質粒雙酶切圖Fig.1 Double enzyme digestion of plasmid

圖2 工程菌可溶性分析電泳圖Fig.2 Electrophoregram analysis of soluble of engineere bacteria (SDS-PAGE)

圖3 FGF20純化電泳圖Fig.3 Electrophoregram analysis of purified FGF20

2.2 抗體的純化

通過多次有限稀釋進行克隆化篩選，獲得1株穩(wěn)定分泌表達FGF20單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為17G3。將雜交瘤細胞株擴增培養(yǎng)后，注射到小鼠腹腔內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生腹水，收集腹水并分離純化。還原型SDS-PAGE結果顯示（圖4），分子量為25 kD和50 kD有兩條帶，分別對應抗體的輕鏈與重鏈。通過凝膠成像軟件分析，純度達到95%以上。

圖4 抗體純化電泳圖Fig.4 Electrophoregram analysis of purified monoclonal antibody

2.3 單克隆抗體的檢測

2.3.1 抗體效價和亞型的分析檢測 收集雜交瘤細胞產(chǎn)生的小鼠腹水，用間接ELISA檢測（n=3）純化后17G3抗體效價，以樣品OD450大于等于陰性對照OD值2.1時，所對應的最大稀釋倍數(shù)為抗體的效價，結果顯示純化后抗體效價為1∶25 600（圖5），經(jīng)ELISA亞型檢測后，雜交瘤細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體亞型為IgG1（圖6）。

圖5 抗體效價分析檢測Fig.5 Antibody titer assay

圖6 抗體亞型分析檢測Fig.6 Antibody subgroup assay

2.3.2 Western Blot分析檢測 Western Blot結果顯示（圖7），在相對分子量為23 kD處可以曝光出條帶，且兩條帶位置相同，說明免疫純化得到的17G3抗體既可以與自制的抗原結合，又能與商品化的FGF20抗原結合，抗原抗體特異性較好。

圖7 Western Blot分析Fig.7 Western Blot assay

2.3.3 表面等離子共振技術（SPR）檢測抗體與FGF20結合動力學特性 將FGF20抗原偶聯(lián)到CM5芯片上，利用BIAcore T200 system對抗原抗體進行親和力檢測，檢測結果顯示離解速率常數(shù)（Kd）為1.07×10-7mol/L（圖8），結果表明17G3抗體與FGF20表現(xiàn)出極強的親和力和穩(wěn)定性?？梢杂糜诤罄m(xù)癌細胞的診斷或者靶向治療。

圖8 SRP檢測抗體與FGF20結合動力學特性Fig.8 Kinetic assay on antibody binding to FGF20 antigen by SPR

3 討論

目前隨著惡性腫瘤的發(fā)病率不斷增高，腫瘤疾病的診斷，治療方法也在不斷進步，單克隆抗體由B淋巴細胞克隆產(chǎn)生，具有高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。在疾病研究及診斷中，單克隆抗體由于其特異性強、均一性好、可大量生產(chǎn)等優(yōu)點，廣泛應用于感染性疾病的診斷、腫瘤診斷及預后判斷等方面。作為治療性抗體藥物，由于專一性強、療效顯著，也可以攜帶特定藥物，通過靶向作用到特定作用位點，用來干預癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的各個信號通路，成為近年來研究的熱點藥物之一。因此，單克隆抗體是重要的研究工具，診斷試劑和臨床治療手段。目前國內(nèi)科研，生產(chǎn)檢測所用到的單克隆抗體，基本為國外進口壟斷，價格不菲，因此自主研發(fā)制備高質量的單克隆抗體顯得十分重要。

有研究表明，F(xiàn)GF20可以與不同的受體結合，從而產(chǎn)生不同的功能。FGFR2介導的信號途徑在癌癥發(fā)展的過程中起到重要作用，F(xiàn)GF20可以與FGFR2結合，從而激活一系列信號活動，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［21-23］。Chamorro等［24］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF20是β-catenin的直接下游靶基因，突變的β-catenin能使RK3E細胞發(fā)生致瘤性轉化，說明在Wnt信號通路中，F(xiàn)GF20是促使腫瘤形成的關鍵因素。Katoh等［25］研究顯示，在胃腸道中，F(xiàn)GF18、FGF20和SPRY4是Wnt信號通路的有效靶點。另外，Katoh［26］研究發(fā)現(xiàn) FGF20、JAG1 和 DKK1 是 Wnt/βcatenin信號級聯(lián)的靶基因，Wnt和FGF信號通路的串擾增強了β-catenin和NFAT信號級聯(lián)。同時姜治國［27］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF20高表達在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中有重要的生物學作用，可能是Wnt/β-catenin信號通路被異常激活。Wnt/β-catenin信號通路的負調節(jié)的表觀遺傳沉默和功能突變存在于多種人類癌癥中，這可能是由于β-catenin的累積導致細胞膜上的表達量減少［23］。目前關于FGF20的單克隆抗體的研究，未見相關報道。總之，隨著不斷的深入研究，制備抗FGF20單克隆抗體，無論是作為腫瘤診斷，還是作為靶向治療都具有潛在的臨床應用價值。

本研究通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，成功構建表達FGF20工程菌，經(jīng)過誘導表達，分離純化獲得了高純度的目的蛋白，通過免疫小鼠制備鼠單克隆抗體，有限稀釋法篩選獲得了1株陽性雜交瘤細胞株，抗體經(jīng)過ELISA效價，WB和SPR檢測，結果顯示可以與自制的FGF20目的蛋白和商品化的FGF20蛋白結合，自制單克隆抗體與FGF20目的蛋白的親和力Kd值達到1.07×10-7mol/L。該雜交瘤細胞株表達的抗體，可用于對組織細胞中FGF20蛋白表達檢測，癌細胞診斷，或者靶向治療等研究。本課題組后續(xù)會進一步進行FGF20單克隆抗體的篩選、配對和FGF20多克隆抗體的制備工作，為開發(fā)快速檢測FGF20的檢測試劑盒做準備。

4 結論

本研究通過構建表達FGF20的原核載體，并在大腸桿菌BL21（DE3）plysS中進行表達，通過分離純化獲得重組蛋白，通過免疫小鼠，有限稀釋法進行單克隆篩選，獲得1株穩(wěn)定分泌抗體的陽性雜交瘤細胞株，通過ELISA、WB等對抗體進行分析鑒定。