鄧普榮 劉勇波
(中國環(huán)境科學研究院 環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室,北京 100012)
噴施化學農(nóng)藥降低了害蟲對經(jīng)濟作物的危害,但同時也帶來了環(huán)境污染問題[1]。轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的商業(yè)化種植降低了化學農(nóng)藥的使用[2]?,F(xiàn)今,轉(zhuǎn)Bt基因棉花(Gossypium hirsutum)、油菜(Brassica napus)和玉米(Zea mays)等已在美國、加拿大等國家廣泛種植[3]。我國也從1997年開始廣泛種植了抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因棉花[3]。隨著轉(zhuǎn)Bt基因植物在田間大面積的連續(xù)種植,使得靶標害蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性進化,影響了轉(zhuǎn)Bt基因植物的抗蟲效果[4]。因此,為延緩靶標害蟲的抗性進化,在轉(zhuǎn)基因植物周邊種植非轉(zhuǎn)基因植物來建立“庇護所”,或者構(gòu)建多個基因的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物[4-5]。此外,也有研究將RNAi技術(shù)與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)相結(jié)合,在大田噴施雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)殺蟲劑或者構(gòu)建雙價轉(zhuǎn)dsRNA+Bt基因植物,延緩靶標害蟲的抗性進化,同時協(xié)同提高作物的抗蟲能力[6-7]。因此,本文將首先介紹RNAi干擾機制及其在農(nóng)業(yè)害蟲防控方面的應用,然后綜述了RNAi干擾技術(shù)協(xié)同轉(zhuǎn)基因抗蟲技術(shù)的研究進展。
1998年,F(xiàn)ire等[8]首 次 在 秀 麗 隱 桿 線 蟲(Caenorhabditis elegans)發(fā)現(xiàn)dsRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默的主要原因,并將這種現(xiàn)象定義為RNAi。RNAi即當外源dsRNA進入宿主細胞后,細胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶Dicer識別并加工dsRNA為21-25 bp的siRNA(small interference RNA,siRNA),siRNA會與細胞內(nèi)特異性的酶結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC),RISC與宿主細胞中特定基因的mRNA結(jié)合,引發(fā)目標基因mRNA的轉(zhuǎn)錄后基因沉默[9-10]。在昆蟲中,dsRNA介導昆蟲基因沉默還需要dsRNA攝取和系統(tǒng)擴散的蛋白參與[11]。昆蟲主要通過兩種方式吸收和傳遞dsRNA,第一種是跨膜蛋白SID-1蛋白(系統(tǒng)RNAi缺陷性蛋白)介導的dsRNA的細胞間轉(zhuǎn)運[12];第二種是通過受體介導的細胞內(nèi)吞作用傳遞 dsRNA[13-14]。
RNAi技術(shù)不僅用于昆蟲尤其是非模式昆蟲的生殖生長、發(fā)育調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)和環(huán)境應答等過程中關(guān)鍵基因的功能分析,也廣泛用于害蟲防治的應用研究中。昆蟲生長發(fā)育中的一些功能基因的干擾常引發(fā)昆蟲的生長發(fā)育的異常,甚至死亡,例如昆蟲的幾丁質(zhì)酶基因[15]、v-ATPase基因[16]、蛹期特異性基因[17]、電子傳遞鏈蛋白[18-19]和昆蟲激素相關(guān)基因[6]。這些基因常作為RNAi害蟲防治的重要靶標。RNAi已用于多種農(nóng)業(yè)害蟲的防治,例如鱗翅目[15]、半翅目[20]、雙翅目[21]、鞘翅目[16]、膜翅目和蜚蠊目[22]等昆蟲,以及線蟲[23]、蜱、螨[24]等的防控研究。使用方法主要有兩種:田間直接噴施dsRNA殺蟲劑和植物介導的RNAi抗蟲技術(shù)。
將dsRNA作為生物農(nóng)藥直接噴施或灌溉常應用于大田害蟲的綜合治理[25-26]。例如將靶向亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼蟲發(fā)育相關(guān)基因的dsRNA溶液噴灑給幼蟲,噴灑的dsRNA能夠穿透亞洲玉米螟幼蟲的體壁,并在昆蟲體腔內(nèi)循環(huán),致使玉米螟幼蟲發(fā)育遲緩[26]。San等[27]在馬鈴薯(Solanum tuberosum)葉片上噴施靶向馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)Actin基因的dsRNA,顯著提高了馬鈴薯甲蟲的死亡率。除了將dsRNA直接噴灑給昆蟲幼蟲和植物葉片引發(fā)死亡,dsRNA也可被植物根系吸收,再由植物維管系統(tǒng)運輸?shù)礁鱾€組織中,引發(fā)攝食植物的昆蟲死亡[28]。用熒光標記的dsEYFP溶液浸泡水稻(Oryza sativa)根系24 h后,水稻鞘和莖部以及取食水稻的稻飛虱(Nilaparvata lugens)體內(nèi)均可檢測到dsEYFP[28]。用dsActin溶液灌溉水稻或玉米能干擾昆蟲Actin基因表達,顯著提高了取食水稻或玉米的稻飛虱和亞洲玉米螟的死亡率[28]。
然而,大田噴施的dsRNA能快速降解,制約了dsRNA的抗蟲效率。Dubelman等[29]在土壤中施用dsDvSnf7后發(fā)現(xiàn),dsRNA會在施用后約2 d內(nèi)降解,并無法檢測到生物活性,dsRNA并未在土壤環(huán)境中持續(xù)存在或積累。Fischer等[30]對釋放到水環(huán)境中的dsDvSnf7殘留時間分析,表明dsRNA在淡水環(huán)境中也能迅速降解。
為了提高在大田噴施dsRNA的抗蟲效率,采用微生物傳遞、脂質(zhì)體修飾和納米材料包埋等釋放dsRNA的新方法[31]。利用微生物傳遞dsRNA時,常將基因工程改造后穩(wěn)定表達dsRNA的微生物施用給昆蟲[32]。將干擾東方黏蟲(Mythimna separata)幾丁質(zhì)酶基因(Chitinase,MseChi)的dsRNA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達,施用該大腸桿菌能有效防控東方粘蟲[15]。利用脂質(zhì)體包埋也可高效傳遞dsRNA,如Huang等[33]用脂質(zhì)體載體包埋的微管蛋白dsRNA能有效防控德國小蠊(Blattella germanica)。此外,DNA納米結(jié)構(gòu)也成為dsRNA高效傳遞的載體[34]。
轉(zhuǎn)dsRNA植物介導的害蟲防治指利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中表達的特異性dsRNA,并通過昆蟲攝食植物引發(fā)昆蟲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默即宿主誘導的基因沉默(host inducing gene silence,HIGS),干擾害蟲新陳代謝和生長發(fā)育的關(guān)鍵基因[35]。擬南 芥(Arabidopsis thaliana)[36]、 煙 草(Nicotiana tobacum)[37]、馬鈴薯[38]、玉米[39]、小麥(Triticum aestivum)[40]、棉花[19]和大豆(Glycine max)[39]等多種作物均培育了轉(zhuǎn)dsRNA基因抗蟲品種。
Mao等[41]最先通過構(gòu)建轉(zhuǎn)dsRNA基因的擬南芥和煙草植株,干擾棉鈴蟲P450單加氧酶基因:CYP6AE14基因的表達,削弱棉鈴蟲對棉酚的耐受性,調(diào)控棉鈴蟲幼蟲的生長發(fā)育。從290個候選基因中鑒定出干擾基因v-ATPase表達最具調(diào)控玉米根葉甲(Diabrotica virgifera virgifera)幼蟲生長的潛力,Baum等[42]將dsv-ATPase A基因轉(zhuǎn)入玉米中,能有效防控玉米根葉甲。
植物介導的RNAi已成功應用于半翅目蚜科害蟲的防治[10,43]。例如在擬南芥中表達靶向桃蚜(Myzus persicae)絲氨酸蛋白酶基因(serine protease,MySP)的dsRNA,顯著降低了桃蚜MySP基因的表達量[44]。將玉米根葉甲v-ATPase C基因的dsRNA轉(zhuǎn)入玉米中,Li等[45]發(fā)現(xiàn)與短鏈RNA相比,長鏈dsRNA能高干擾玉米根葉甲v-ATPase C基因表達。將靶向棉鈴蟲幾丁質(zhì)酶基因(HaCHI)的dsRNA轉(zhuǎn)入煙草和番茄(Lycopersicon esculentum)中,致使棉鈴蟲幼蟲發(fā)育畸形[46]。以番茄潛葉蛾(Tuta absoluta)v-ATPase A和精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)基因為干擾靶點,將針對v-ATPase A和AK的dsRNA轉(zhuǎn)入番茄葉片中,番茄潛葉蛾幼蟲死亡率增加,減少了昆蟲取食對番茄葉片的損傷[47]。將針對根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)的16D10轉(zhuǎn)入葡萄(Vitis vinifera)根系,抑制了根結(jié)線蟲對葡萄根系的侵染[23]。
轉(zhuǎn)dsRNA植物介導的RNAi技術(shù)優(yōu)化了dsRNA的傳遞方式,但dsRNA易被植物細胞質(zhì)中的Dicer酶降解為小片段,影響長鏈dsRNA的完整性[48]。而且昆蟲腸道中的RNase也會降解昆蟲攝食的dsRNA,降低dsRNA的干擾效率,影響殺蟲效果[49]。Bally等[50-52]提出將dsRNA在植物細胞器—葉綠體中表達的方法,保護了轉(zhuǎn)基因植物中dsRNA的完整性,提高了dsRNA從植物到昆蟲的傳遞效率。
隨著轉(zhuǎn)Bt基因植物的連續(xù)種植,靶標害蟲對轉(zhuǎn)Bt基因植物進化產(chǎn)生抗性[4,53]。靶標害蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性進化的分子機制是:靶標害蟲中腸環(huán)境中蛋白酶[54-55]的改變和中腸刷狀緣膜囊上Bt蛋白特異性受體蛋白如類鈣黏蛋白[56]、堿性磷酸酶、氨肽酶N[57]與ABC轉(zhuǎn)運蛋白[58]等多種蛋白的突變常引起B(yǎng)t蛋白抗性[59-60]。為減緩靶標害蟲對轉(zhuǎn)Bt基因作物產(chǎn)生抗性進化,主要有以下幾種方法:(1)通過串聯(lián)疊加多種抗蟲基因,擴大轉(zhuǎn)基因植物的殺蟲譜,例如轉(zhuǎn)Bt和豇豆胰蛋白酶抑制劑(Cowpea trypsin inhibitor,CPT1)基因(Cry1Ac+CPT1)水稻[61]、轉(zhuǎn)Cry1Ah+Cry1Ie基因玉米[62]和轉(zhuǎn)融合Bt與蘇云金芽胞桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vegetative insecticidal protein,Vip)基因(Cry1Ab+Vip3A)水稻[63]。然而,由于多種抗蟲蛋白存在交互抗性現(xiàn)象,這種串聯(lián)疊加多種抗蟲基因減緩靶標害蟲抗性進化還有待深入研究[64];(2)高劑量表達Bt蛋白提高轉(zhuǎn)基因作物對靶標害蟲的毒性,使得抗性等位基因不能遺傳給下一代[65-66],如果抗性表現(xiàn)為隱性遺傳,高劑量表達能有效延緩靶標害蟲的抗性進化。然而,高劑量策略對其他抗性類型的昆蟲帶來高選擇壓力,加速其抗性進化;(3)此外,構(gòu)建非轉(zhuǎn)基因植物“庇護所”的方法能有效延緩害蟲抗性進化[4]。
將RNAi和轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)結(jié)合研發(fā)雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲作物,增加昆蟲對Bt蛋白的敏感性以提高殺蟲效率,成為延緩靶標害蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性進化的有效途徑之一。例如,孟山都公司研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)dsDvSnf7玉米對抗玉米根葉甲的抑制作用[67],并培育出轉(zhuǎn)dsDvSnf7和Cry3Bb1基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的新品種MON87411并在市場中推廣種植[7,68]。
首先,RNAi和Bt蛋白能否聯(lián)合協(xié)同抗蟲需要找到昆蟲生長發(fā)育和新陳代謝中的關(guān)鍵基因。胰凝乳蛋白酶(chymotrypsins,CTP)作為鱗翅目昆蟲的一種主要的蛋白水解消化酶類,在昆蟲體內(nèi)降解活化的Bt毒素、降低Bt毒性、誘導抗蟲性方面發(fā)揮重要作用。通過 RNAi干擾亞洲玉米螟幼蟲中的7個CTP基因,顯著提高了Cry1Ab蛋白對亞洲玉米螟幼蟲的死亡率[69]。有研究表明,抑制甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合酶B基因(Chitin synthase B,CHS-B)的表達,可顯著增加其幼蟲的死亡率,飼喂dsCHS-B也提高了Cry1Ac和Cry1Ca蛋白對甜菜夜蛾幼蟲的毒性[70]。影響昆蟲激素代謝的關(guān)鍵酶類也成為RNAi與轉(zhuǎn)Bt基因協(xié)同抗蟲的作用靶標。通過RNAi抑制昆蟲保幼激素(juvenile hormone,JH)代謝中的保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶(JH acid methyltransferase,JHAMT)和保幼激素結(jié)合蛋白(JH-binding protein,JHBP)基因,培育轉(zhuǎn)Bt基因和dsRNA的雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花顯著增加靶標害蟲致死率,延緩了靶標害蟲對Bt蛋白的抗性進化[6]。v-ATPase是質(zhì)子泵在昆蟲中為新陳代謝供能,RNAi抑制棉鈴蟲中v-ATPase A基因的表達,提高了棉鈴蟲幼蟲對活化的Cry1Ac蛋白的敏感性[71]。因此,RNAi干擾昆蟲關(guān)鍵功能基因的表達,提高害蟲對Bt蛋白的敏感性,提升Bt毒素的殺蟲效果成為減緩昆蟲對Bt蛋白抗性的有效方法[6,69]。
其次,RNAi和轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)能否協(xié)同抗蟲,需要研究RNAi干擾昆蟲的功能基因是否影響B(tài)t毒蛋白對靶標害蟲的殺蟲效果。向甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼蟲體內(nèi)注射抑制抗菌肽gloverin—Seglv的dsRNA,提高了甜菜夜蛾對Bt蛋白的敏感性[72]。Ochoa-Campuzano等[73]在馬鈴薯甲蟲中也有類似發(fā)現(xiàn),抑制馬鈴薯甲蟲幼蟲中與Bt蛋白互作的腸膜蛋白—prohibitin-1蛋白表達,幼蟲對Cry3Aa蛋白的敏感性增強,使得昆蟲在培養(yǎng)的第5天死亡率達到100%。由于Sl102基因在海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)血細胞中高表達,參與細胞的免疫過程,通過大腸桿菌介導的RNAi抑制Sl102基因的表達后,增加了?;页嵋苟陮ry1Ca蛋白的敏感性[74-75]。通過小菜蛾(Plutella xylostella)Bt蛋白抗性種群和敏感種群進行中腸轉(zhuǎn)錄本的表達差異分析,發(fā)現(xiàn)3個基因:PxSDF2L1、PxCDKAL1和PxHEL-1在抗性品系中顯著上調(diào)表達,用RNAi抑制這3種基因的表達,對Bt蛋白抗性和敏感小菜蛾幼蟲的死亡率都增加,與敏感系相比抗性群體的死亡率上升更為顯著[60]。由此可見,由RNAi介導的抑制昆蟲功能基因可以協(xié)同Bt蛋白介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于害蟲防治(表1)。
表1 RNAi與轉(zhuǎn)Bt基因技術(shù)協(xié)同抗蟲Table 1 Synergistic application of RNAi and Bt-transgenic technologies in controlling pests
RNAi干擾與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)結(jié)合不僅有望延緩靶標害蟲對Bt蛋白的抗性進化,同時RNAi抗蟲技術(shù)具有序列特異性和種屬特異性的優(yōu)勢,可防治特定的害蟲種類(表2)。兩種生物抗蟲技術(shù)的結(jié)合有望成為一種綠色環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展的害蟲綜合防控技術(shù)。
表2 RNAi技術(shù)應用于農(nóng)業(yè)害蟲防控Table 2 RNAi technology applied in controlling agricultural pests
然而,RNAi干擾與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)協(xié)同抗蟲面臨一些挑戰(zhàn)。首先,RNAi技術(shù)在應用于抗蟲的過程中受到一些因素的制約:(1)RNAi的干擾效率受到昆蟲對dsRNA的傳遞吸收效率、劑量效應、目的基因組織特異性的影響,同時農(nóng)業(yè)害蟲的生命周期和攝食行為也是干擾RNAi效率的重要因素[79-81];(2)dsRNA不但引發(fā)靶基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默,還可能引發(fā)非靶標基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默而產(chǎn)生脫靶效應[82];(3)針對靶標害蟲特異性的dsRNA可能影響非靶標害蟲的種群動態(tài)[83]。
其次,將RNAi技術(shù)與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)聯(lián)合用于大田面臨一些技術(shù)難題。例如昆蟲的一些重要功能基因是否都可用RNAi技術(shù)實現(xiàn)高效基因沉默?害蟲攝取的RNAi是否會被其序列多態(tài)性所規(guī)避[84]?由于害蟲對Bt蛋白存在著抗性進化,轉(zhuǎn)dsRNA和Bt基因的雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否也會在田間連續(xù)種植栽培中對dsRNA產(chǎn)生抗性而降低其抗蟲效果[85]?在RNAi和轉(zhuǎn)Bt基因聯(lián)合作用時,dsRNA與Bt蛋白二者之間作用的獨立效應已得到證明,但兩種方式的獨立作用是否與RNAi選擇的靶基因存在交互影響還有待深入研究[7]。
此外,基于轉(zhuǎn)dsRNA和Bt基因雙價轉(zhuǎn)基因植物釋放的環(huán)境安全性和食品安全性的評估目前仍不充分,缺乏對雙價或多價轉(zhuǎn)基因植物的評估標準。