鄧普榮 劉勇波

（中國環(huán)境科學研究院 環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012）

噴施化學農(nóng)藥降低了害蟲對經(jīng)濟作物的危害，但同時也帶來了環(huán)境污染問題［1］。轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的商業(yè)化種植降低了化學農(nóng)藥的使用［2］?，F(xiàn)今，轉(zhuǎn)Bt基因棉花（Gossypium hirsutum）、油菜（Brassica napus）和玉米（Zea mays）等已在美國、加拿大等國家廣泛種植［3］。我國也從1997年開始廣泛種植了抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因棉花［3］。隨著轉(zhuǎn)Bt基因植物在田間大面積的連續(xù)種植，使得靶標害蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性進化，影響了轉(zhuǎn)Bt基因植物的抗蟲效果［4］。因此，為延緩靶標害蟲的抗性進化，在轉(zhuǎn)基因植物周邊種植非轉(zhuǎn)基因植物來建立“庇護所”，或者構(gòu)建多個基因的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物［4-5］。此外，也有研究將RNAi技術(shù)與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)相結(jié)合，在大田噴施雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）殺蟲劑或者構(gòu)建雙價轉(zhuǎn)dsRNA+Bt基因植物，延緩靶標害蟲的抗性進化，同時協(xié)同提高作物的抗蟲能力［6-7］。因此，本文將首先介紹RNAi干擾機制及其在農(nóng)業(yè)害蟲防控方面的應用，然后綜述了RNAi干擾技術(shù)協(xié)同轉(zhuǎn)基因抗蟲技術(shù)的研究進展。

1 RNAi干擾機制

1998年，F(xiàn)ire等［8］首 次 在 秀 麗 隱 桿 線 蟲（Caenorhabditis elegans）發(fā)現(xiàn)dsRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默的主要原因，并將這種現(xiàn)象定義為RNAi。RNAi即當外源dsRNA進入宿主細胞后，細胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶Dicer識別并加工dsRNA為21-25 bp的siRNA（small interference RNA，siRNA），siRNA會與細胞內(nèi)特異性的酶結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC與宿主細胞中特定基因的mRNA結(jié)合，引發(fā)目標基因mRNA的轉(zhuǎn)錄后基因沉默［9-10］。在昆蟲中，dsRNA介導昆蟲基因沉默還需要dsRNA攝取和系統(tǒng)擴散的蛋白參與［11］。昆蟲主要通過兩種方式吸收和傳遞dsRNA，第一種是跨膜蛋白SID-1蛋白（系統(tǒng)RNAi缺陷性蛋白）介導的dsRNA的細胞間轉(zhuǎn)運［12］；第二種是通過受體介導的細胞內(nèi)吞作用傳遞 dsRNA［13-14］。

2 RNAi技術(shù)應用于農(nóng)業(yè)害蟲防控

RNAi技術(shù)不僅用于昆蟲尤其是非模式昆蟲的生殖生長、發(fā)育調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)和環(huán)境應答等過程中關(guān)鍵基因的功能分析，也廣泛用于害蟲防治的應用研究中。昆蟲生長發(fā)育中的一些功能基因的干擾常引發(fā)昆蟲的生長發(fā)育的異常，甚至死亡，例如昆蟲的幾丁質(zhì)酶基因［15］、v-ATPase基因［16］、蛹期特異性基因［17］、電子傳遞鏈蛋白［18-19］和昆蟲激素相關(guān)基因［6］。這些基因常作為RNAi害蟲防治的重要靶標。RNAi已用于多種農(nóng)業(yè)害蟲的防治，例如鱗翅目［15］、半翅目［20］、雙翅目［21］、鞘翅目［16］、膜翅目和蜚蠊目［22］等昆蟲，以及線蟲［23］、蜱、螨［24］等的防控研究。使用方法主要有兩種：田間直接噴施dsRNA殺蟲劑和植物介導的RNAi抗蟲技術(shù)。

2.1 噴施dsRNA殺蟲劑

將dsRNA作為生物農(nóng)藥直接噴施或灌溉常應用于大田害蟲的綜合治理［25-26］。例如將靶向亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）幼蟲發(fā)育相關(guān)基因的dsRNA溶液噴灑給幼蟲，噴灑的dsRNA能夠穿透亞洲玉米螟幼蟲的體壁，并在昆蟲體腔內(nèi)循環(huán)，致使玉米螟幼蟲發(fā)育遲緩［26］。San等［27］在馬鈴薯（Solanum tuberosum）葉片上噴施靶向馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）Actin基因的dsRNA，顯著提高了馬鈴薯甲蟲的死亡率。除了將dsRNA直接噴灑給昆蟲幼蟲和植物葉片引發(fā)死亡，dsRNA也可被植物根系吸收，再由植物維管系統(tǒng)運輸?shù)礁鱾€組織中，引發(fā)攝食植物的昆蟲死亡［28］。用熒光標記的dsEYFP溶液浸泡水稻（Oryza sativa）根系24 h后，水稻鞘和莖部以及取食水稻的稻飛虱（Nilaparvata lugens）體內(nèi)均可檢測到dsEYFP［28］。用dsActin溶液灌溉水稻或玉米能干擾昆蟲Actin基因表達，顯著提高了取食水稻或玉米的稻飛虱和亞洲玉米螟的死亡率［28］。

然而，大田噴施的dsRNA能快速降解，制約了dsRNA的抗蟲效率。Dubelman等［29］在土壤中施用dsDvSnf7后發(fā)現(xiàn)，dsRNA會在施用后約2 d內(nèi)降解，并無法檢測到生物活性，dsRNA并未在土壤環(huán)境中持續(xù)存在或積累。Fischer等［30］對釋放到水環(huán)境中的dsDvSnf7殘留時間分析，表明dsRNA在淡水環(huán)境中也能迅速降解。

為了提高在大田噴施dsRNA的抗蟲效率，采用微生物傳遞、脂質(zhì)體修飾和納米材料包埋等釋放dsRNA的新方法［31］。利用微生物傳遞dsRNA時，常將基因工程改造后穩(wěn)定表達dsRNA的微生物施用給昆蟲［32］。將干擾東方黏蟲（Mythimna separata）幾丁質(zhì)酶基因（Chitinase，MseChi）的dsRNA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達，施用該大腸桿菌能有效防控東方粘蟲［15］。利用脂質(zhì)體包埋也可高效傳遞dsRNA，如Huang等［33］用脂質(zhì)體載體包埋的微管蛋白dsRNA能有效防控德國小蠊（Blattella germanica）。此外，DNA納米結(jié)構(gòu)也成為dsRNA高效傳遞的載體［34］。

2.2 轉(zhuǎn)dsRNA植物介導的害蟲防治

轉(zhuǎn)dsRNA植物介導的害蟲防治指利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中表達的特異性dsRNA，并通過昆蟲攝食植物引發(fā)昆蟲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默即宿主誘導的基因沉默（host inducing gene silence，HIGS），干擾害蟲新陳代謝和生長發(fā)育的關(guān)鍵基因［35］。擬南 芥（Arabidopsis thaliana）［36］、 煙 草（Nicotiana tobacum）［37］、馬鈴薯［38］、玉米［39］、小麥（Triticum aestivum）［40］、棉花［19］和大豆（Glycine max）［39］等多種作物均培育了轉(zhuǎn)dsRNA基因抗蟲品種。

Mao等［41］最先通過構(gòu)建轉(zhuǎn)dsRNA基因的擬南芥和煙草植株，干擾棉鈴蟲P450單加氧酶基因：CYP6AE14基因的表達，削弱棉鈴蟲對棉酚的耐受性，調(diào)控棉鈴蟲幼蟲的生長發(fā)育。從290個候選基因中鑒定出干擾基因v-ATPase表達最具調(diào)控玉米根葉甲（Diabrotica virgifera virgifera）幼蟲生長的潛力，Baum等［42］將dsv-ATPase A基因轉(zhuǎn)入玉米中，能有效防控玉米根葉甲。

植物介導的RNAi已成功應用于半翅目蚜科害蟲的防治［10，43］。例如在擬南芥中表達靶向桃蚜（Myzus persicae）絲氨酸蛋白酶基因（serine protease，MySP）的dsRNA，顯著降低了桃蚜MySP基因的表達量［44］。將玉米根葉甲v-ATPase C基因的dsRNA轉(zhuǎn)入玉米中，Li等［45］發(fā)現(xiàn)與短鏈RNA相比，長鏈dsRNA能高干擾玉米根葉甲v-ATPase C基因表達。將靶向棉鈴蟲幾丁質(zhì)酶基因（HaCHI）的dsRNA轉(zhuǎn)入煙草和番茄（Lycopersicon esculentum）中，致使棉鈴蟲幼蟲發(fā)育畸形［46］。以番茄潛葉蛾（Tuta absoluta）v-ATPase A和精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）基因為干擾靶點，將針對v-ATPase A和AK的dsRNA轉(zhuǎn)入番茄葉片中，番茄潛葉蛾幼蟲死亡率增加，減少了昆蟲取食對番茄葉片的損傷［47］。將針對根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）的16D10轉(zhuǎn)入葡萄（Vitis vinifera）根系，抑制了根結(jié)線蟲對葡萄根系的侵染［23］。

轉(zhuǎn)dsRNA植物介導的RNAi技術(shù)優(yōu)化了dsRNA的傳遞方式，但dsRNA易被植物細胞質(zhì)中的Dicer酶降解為小片段，影響長鏈dsRNA的完整性［48］。而且昆蟲腸道中的RNase也會降解昆蟲攝食的dsRNA，降低dsRNA的干擾效率，影響殺蟲效果［49］。Bally等［50-52］提出將dsRNA在植物細胞器—葉綠體中表達的方法，保護了轉(zhuǎn)基因植物中dsRNA的完整性，提高了dsRNA從植物到昆蟲的傳遞效率。

3 靶標害蟲對轉(zhuǎn)Bt基因植物的抗性進化

隨著轉(zhuǎn)Bt基因植物的連續(xù)種植，靶標害蟲對轉(zhuǎn)Bt基因植物進化產(chǎn)生抗性［4，53］。靶標害蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性進化的分子機制是：靶標害蟲中腸環(huán)境中蛋白酶［54-55］的改變和中腸刷狀緣膜囊上Bt蛋白特異性受體蛋白如類鈣黏蛋白［56］、堿性磷酸酶、氨肽酶N［57］與ABC轉(zhuǎn)運蛋白［58］等多種蛋白的突變常引起B(yǎng)t蛋白抗性［59-60］。為減緩靶標害蟲對轉(zhuǎn)Bt基因作物產(chǎn)生抗性進化，主要有以下幾種方法：（1）通過串聯(lián)疊加多種抗蟲基因，擴大轉(zhuǎn)基因植物的殺蟲譜，例如轉(zhuǎn)Bt和豇豆胰蛋白酶抑制劑（Cowpea trypsin inhibitor，CPT1）基因（Cry1Ac+CPT1）水稻［61］、轉(zhuǎn)Cry1Ah+Cry1Ie基因玉米［62］和轉(zhuǎn)融合Bt與蘇云金芽胞桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetative insecticidal protein，Vip）基因（Cry1Ab+Vip3A）水稻［63］。然而，由于多種抗蟲蛋白存在交互抗性現(xiàn)象，這種串聯(lián)疊加多種抗蟲基因減緩靶標害蟲抗性進化還有待深入研究［64］；（2）高劑量表達Bt蛋白提高轉(zhuǎn)基因作物對靶標害蟲的毒性，使得抗性等位基因不能遺傳給下一代［65-66］，如果抗性表現(xiàn)為隱性遺傳，高劑量表達能有效延緩靶標害蟲的抗性進化。然而，高劑量策略對其他抗性類型的昆蟲帶來高選擇壓力，加速其抗性進化；（3）此外，構(gòu)建非轉(zhuǎn)基因植物“庇護所”的方法能有效延緩害蟲抗性進化［4］。

4 RNAi與轉(zhuǎn)Bt基因技術(shù)協(xié)同抗蟲

將RNAi和轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)結(jié)合研發(fā)雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲作物，增加昆蟲對Bt蛋白的敏感性以提高殺蟲效率，成為延緩靶標害蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性進化的有效途徑之一。例如，孟山都公司研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)dsDvSnf7玉米對抗玉米根葉甲的抑制作用［67］，并培育出轉(zhuǎn)dsDvSnf7和Cry3Bb1基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的新品種MON87411并在市場中推廣種植［7，68］。

首先，RNAi和Bt蛋白能否聯(lián)合協(xié)同抗蟲需要找到昆蟲生長發(fā)育和新陳代謝中的關(guān)鍵基因。胰凝乳蛋白酶（chymotrypsins，CTP）作為鱗翅目昆蟲的一種主要的蛋白水解消化酶類，在昆蟲體內(nèi)降解活化的Bt毒素、降低Bt毒性、誘導抗蟲性方面發(fā)揮重要作用。通過 RNAi干擾亞洲玉米螟幼蟲中的7個CTP基因，顯著提高了Cry1Ab蛋白對亞洲玉米螟幼蟲的死亡率［69］。有研究表明，抑制甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合酶B基因（Chitin synthase B，CHS-B）的表達，可顯著增加其幼蟲的死亡率，飼喂dsCHS-B也提高了Cry1Ac和Cry1Ca蛋白對甜菜夜蛾幼蟲的毒性［70］。影響昆蟲激素代謝的關(guān)鍵酶類也成為RNAi與轉(zhuǎn)Bt基因協(xié)同抗蟲的作用靶標。通過RNAi抑制昆蟲保幼激素（juvenile hormone，JH）代謝中的保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶（JH acid methyltransferase，JHAMT）和保幼激素結(jié)合蛋白（JH-binding protein，JHBP）基因，培育轉(zhuǎn)Bt基因和dsRNA的雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花顯著增加靶標害蟲致死率，延緩了靶標害蟲對Bt蛋白的抗性進化［6］。v-ATPase是質(zhì)子泵在昆蟲中為新陳代謝供能，RNAi抑制棉鈴蟲中v-ATPase A基因的表達，提高了棉鈴蟲幼蟲對活化的Cry1Ac蛋白的敏感性［71］。因此，RNAi干擾昆蟲關(guān)鍵功能基因的表達，提高害蟲對Bt蛋白的敏感性，提升Bt毒素的殺蟲效果成為減緩昆蟲對Bt蛋白抗性的有效方法［6，69］。

其次，RNAi和轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)能否協(xié)同抗蟲，需要研究RNAi干擾昆蟲的功能基因是否影響B(tài)t毒蛋白對靶標害蟲的殺蟲效果。向甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼蟲體內(nèi)注射抑制抗菌肽gloverin—Seglv的dsRNA，提高了甜菜夜蛾對Bt蛋白的敏感性［72］。Ochoa-Campuzano等［73］在馬鈴薯甲蟲中也有類似發(fā)現(xiàn)，抑制馬鈴薯甲蟲幼蟲中與Bt蛋白互作的腸膜蛋白—prohibitin-1蛋白表達，幼蟲對Cry3Aa蛋白的敏感性增強，使得昆蟲在培養(yǎng)的第5天死亡率達到100%。由于Sl102基因在海灰翅夜蛾（Spodoptera littoralis）血細胞中高表達，參與細胞的免疫過程，通過大腸桿菌介導的RNAi抑制Sl102基因的表達后，增加了?；页嵋苟陮ry1Ca蛋白的敏感性［74-75］。通過小菜蛾（Plutella xylostella）Bt蛋白抗性種群和敏感種群進行中腸轉(zhuǎn)錄本的表達差異分析，發(fā)現(xiàn)3個基因：PxSDF2L1、PxCDKAL1和PxHEL-1在抗性品系中顯著上調(diào)表達，用RNAi抑制這3種基因的表達，對Bt蛋白抗性和敏感小菜蛾幼蟲的死亡率都增加，與敏感系相比抗性群體的死亡率上升更為顯著［60］。由此可見，由RNAi介導的抑制昆蟲功能基因可以協(xié)同Bt蛋白介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于害蟲防治（表1）。

表1 RNAi與轉(zhuǎn)Bt基因技術(shù)協(xié)同抗蟲Table 1 Synergistic application of RNAi and Bt-transgenic technologies in controlling pests

5 展望

RNAi干擾與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)結(jié)合不僅有望延緩靶標害蟲對Bt蛋白的抗性進化，同時RNAi抗蟲技術(shù)具有序列特異性和種屬特異性的優(yōu)勢，可防治特定的害蟲種類（表2）。兩種生物抗蟲技術(shù)的結(jié)合有望成為一種綠色環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展的害蟲綜合防控技術(shù)。

表2 RNAi技術(shù)應用于農(nóng)業(yè)害蟲防控Table 2 RNAi technology applied in controlling agricultural pests

然而，RNAi干擾與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)協(xié)同抗蟲面臨一些挑戰(zhàn)。首先，RNAi技術(shù)在應用于抗蟲的過程中受到一些因素的制約：（1）RNAi的干擾效率受到昆蟲對dsRNA的傳遞吸收效率、劑量效應、目的基因組織特異性的影響，同時農(nóng)業(yè)害蟲的生命周期和攝食行為也是干擾RNAi效率的重要因素［79-81］；（2）dsRNA不但引發(fā)靶基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，還可能引發(fā)非靶標基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默而產(chǎn)生脫靶效應［82］；（3）針對靶標害蟲特異性的dsRNA可能影響非靶標害蟲的種群動態(tài)［83］。

其次，將RNAi技術(shù)與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲技術(shù)聯(lián)合用于大田面臨一些技術(shù)難題。例如昆蟲的一些重要功能基因是否都可用RNAi技術(shù)實現(xiàn)高效基因沉默？害蟲攝取的RNAi是否會被其序列多態(tài)性所規(guī)避［84］？由于害蟲對Bt蛋白存在著抗性進化，轉(zhuǎn)dsRNA和Bt基因的雙價轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否也會在田間連續(xù)種植栽培中對dsRNA產(chǎn)生抗性而降低其抗蟲效果［85］？在RNAi和轉(zhuǎn)Bt基因聯(lián)合作用時，dsRNA與Bt蛋白二者之間作用的獨立效應已得到證明，但兩種方式的獨立作用是否與RNAi選擇的靶基因存在交互影響還有待深入研究［7］。

此外，基于轉(zhuǎn)dsRNA和Bt基因雙價轉(zhuǎn)基因植物釋放的環(huán)境安全性和食品安全性的評估目前仍不充分，缺乏對雙價或多價轉(zhuǎn)基因植物的評估標準。