葉娜 張曉蘭 包鵬甲 王興東 閻萍 潘和平

（1. 西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050）

皮膚是哺乳動物中最大、最復雜的器官之一，主要由表皮及其附屬器官構成［1］。小鼠表皮主要由不同生理功能的兩個部分組成，濾泡間上皮（interfollicular epithelium，IFE）和毛囊（hair follicle，HF），還包括皮脂腺（sebaceous gland，SG）［2］。濾泡間上皮細胞是構成上皮細胞和扁平復層上皮的主要成分，在保護皮膚屏障功能方面起著關鍵作用［3］。毛囊的形成是表皮上皮和間質真皮及其特殊衍生物真皮濃縮物（dermal concentrate，DC）、真皮乳頭（dermal papilla，DP）等相互作用并進行信號傳遞的結果。成熟的HF結構復雜，主要由毛干和內根鞘上皮細胞組成的同心環(huán)、隆起部儲備的干細胞以及毛球底部的基質細胞等構成［4-6］。胚胎期HF的形態(tài)發(fā)生經(jīng)歷誘導期、器官發(fā)生和細胞分化3個時期。出生后HF的生長會發(fā)生動態(tài)變化，并以周期性的方式持續(xù)下去。毛發(fā)生長周期可分為3個階段：休止期、生長期和退行期［7-10］，每個階段都受到特定遺傳模式的調節(jié)［11］。在毛發(fā)的生長階段，DP起著信號指導的作用［12-14］，促使轉運擴大祖細胞增殖、向上遷移并分化為幾層軸鞘和內根鞘細胞系［14-15］。目前HF的復雜性還未得到充分的揭示，在HF周期性生長分子調控機制的研究中，多以多種類型組織（真皮、表皮、HF）等混合的皮膚做為起始樣本，沒有從中分離出勻質性單細胞，這使得細胞之間相互作用的生物差異有可能被平均值所掩蓋或是被誤認做為技術噪音?；騼H對HF自身進行了研究，而忽略了HF組織周圍真皮、表皮與HF互作對周期性生長的影響。但隨著技術的更新，HF的研究更上一個層次。有報道利用scRNA-seq對HF形態(tài)發(fā)生過程中的調控機制進行研究［16-18］。亦有對小鼠成熟HF不同發(fā)育階段的空間調控機制的研究［19-20］。但HF發(fā)育調控機制上還有許多問題沒有解決，有待進一步的研究。

由于技術限制，傳統(tǒng)的轉錄組測序只能測得細胞群體中多數(shù)基因表達水平的“平均數(shù)據(jù)”，主要反映優(yōu)勢細胞亞群的生物學信息，而小細胞亞群的作用往往被忽視，從而可能掩蓋了這部分細胞所攜帶的重要信息［21］。隨著高通量測序技術的發(fā)展，大規(guī)模測序平臺使大量DNA和RNA分子同時測序成為可能，這為各個領域的研究人員同時研究生物體的遺傳信息和轉錄信息提供很大幫助。因此，利用全基因組、轉錄組和表觀遺傳修飾的數(shù)據(jù)進行更深入的分析，對全面揭示基因表達調控的異質性更為必要［22］。理解器官的發(fā)育和功能需要對其成分加以了解，即組成器官或組織的不同細胞類型。剖析器官的細胞組成類型或探索同一類型細胞間轉錄組異質性的理想方法是對樣本中隨機抽取的單個細胞進行單獨的分析。單細胞水平的分析方法包括RNA原位雜交，蛋白質免疫染色，或熒光嵌合蛋白，都是基于細胞特異性表達的表面標記物或熒光報告蛋白進行，這些方法只能監(jiān)測每個試驗中的少數(shù)基因。單細胞轉錄組測序技術是一種能夠獲得細胞中所有mRNA的單細胞水平的分析方法，它可對單個細胞進行無偏、高通量以及高分辨率的轉錄組測序分析。2009年，北京大學的湯富酬教授在Nature Methods上首次報道了單細胞轉錄組測序的研究，從此掀開了單細胞測序技術的篇章［23］。scRNA-seq是通過二代測序技術（next generation sequencing）來識別單個細胞的轉錄組表達信息，分析細胞間遺傳和基因表達水平的差異，同時解決用組織樣本測序無法解決的細胞異質性難題，從而更好地了解單個細胞在微環(huán)境中的功能［24］，并可以揭示復雜和稀有的細胞群體以及基因之間的調節(jié)關系，跟蹤不同細胞譜系在發(fā)育過程中的軌跡，揭示單個細胞的獨特性，進而解決批量分析中無法解決的問題［25-26］。目前，scRNA-seq已被應用于鑒別健康組織的細胞類型［27］、發(fā)現(xiàn)新的細胞類型［28-30］、探索發(fā)育生物學過程的動力學［31-32］、識別基因調控機制［33］，以及描述腫瘤的異質性等［34-35］。本文就單細胞技術的發(fā)展、分離技術及其在HF發(fā)育調控研究中的應用展開敘述，以期為揭示HF發(fā)育的分子調控機制研究提供理論參考。

1 scRNA-seq的發(fā)展歷程

scRNA-seq始于單細胞qPCR的發(fā)展，跟單分子FISH一樣，都是對轉錄物靶向分析的一種方法［36］。2009年，湯富酬首次報道單細胞測序的研究，但是該方法只適用于少數(shù)珍貴細胞基因表達的深度測序［23］，2011年，Islam等［37］研發(fā)了一種基于單細胞標記逆轉錄測序方法，即單細胞標記逆轉錄測序（single-cell tagged reverse transcription sequencing，STRT-seq），它是利用5′tag計數(shù)轉錄本的單細胞方法之一，在microfluidigm C1平臺（STRT-C1）上進行的STRT-seq是一種靈活的scRNA-seq方法，可在單細胞水平上對轉錄本進行準確、敏感和重要的分子計數(shù)［38］。隨后，Hashimshony等［39］又研發(fā)出CEL-seq（cell expression by linear amplification and sequencing），該方法克服了RNA在細胞中由于起始量小的局限，通過給樣本匯集條形碼來滿足IVT（in vitro transcription）線性擴增對材料的要求，從而允許從單個細胞中高效線性擴增RNA，同時通過測序對其進行分析。擴增后DNA的兩端深度測序能夠準確檢測兩條鏈的序列，該方法比基于PCR的擴增方法具有更高的重復性、敏感性，CEL-Seq支持轉錄組量化，將有助于不同細胞類型群體的復雜組織的轉錄組分析。這種方法的缺點是具有強烈的3′端偏好。2013年，Picelli［40］引入了Smart-seq2，該方法可以完整覆蓋轉錄本的全長，實現(xiàn)了轉錄本異構體和SNV檢測，同時改進了逆轉錄、模板轉換和前置擴增等功能，以增加單個細胞生成的cDNA文庫的產(chǎn)量和長度。與Smart-seq［41］轉錄組庫相比，Smartseq2轉錄組庫在檢測、覆蓋率、偏倚和準確性方面都有所提高，并且使用現(xiàn)成的試劑生成，成本更低，但其只能對具有poly（A）尾巴的mRNA進行擴增和檢測。2014年，Jaitin［27］研發(fā)的MARS-seq（massively parallel single cell RNA-seq）問世，它是一種自動化的大規(guī)模單細胞RNA測序方法，用于分析數(shù)千個單個細胞的體內轉錄狀態(tài)。2015年，哈佛大學的兩個團隊開發(fā)出 inDrop［42］和 Drop-seq［43］兩種單細胞測序技術，兩種方法都是基于高通量液滴微流控裝置，將數(shù)千個細胞分離成納米大小的液滴，然后不同的條形碼再與每個細胞的RNA聯(lián)系起來并通過二代測序進行后續(xù)分析。2017年，商業(yè)化的10×Genomics Chromium出現(xiàn)，該項技術由10×Genomics公司和Fred Hutchinson癌癥研究中心共同研發(fā)，它可實現(xiàn)大量細胞的快速標記、測序與分析，并獲得單細胞水平的基因表達譜和差異情況，通過對復雜的細胞群體進行的細致分析，繪制大規(guī)模單細胞表達圖譜［44］。2017年，浙大教授開發(fā)了microwell-seq，一個使用簡單、廉價設備的高通量、低成本的scRNA-seq平臺，利用該平臺，該團隊首次繪制出哺乳動物的細胞圖譜，還構建了一個基于單細胞數(shù)字表達精確定義細胞類型的“單細胞MCA（ScMCA）”工具［45］。同年還有一種基于微孔陣列的Seq-Well技術，這是一個簡單、便攜、低成本的大規(guī)模并行的scRNA-seq平臺，它將單個細胞和條形碼mRNA捕獲珠密封在微孔陣列板中，從而實現(xiàn)高效的細胞裂解和轉錄本捕獲［46］。另外還有一種基于組合標記的SPLiT-seq［47］，該技術成本低廉，能夠在一次試驗中對成千上萬個固定的細胞或細胞核進行轉錄分析且不需要將單個細胞劃分為單獨的隔間（液滴、微孔），而是依賴于細胞本身作為隔間。測序的整個工作流程只包括移液步驟，不需要復雜的儀器。

2 單細胞制備

2.1 單細胞懸液準備

單細胞分離是單細胞測序最關鍵的步驟，為了在下游分析過程中保持細胞的存活力，尋找溫和有效的單細胞分離方法非常必要。單細胞測序前需將組織解離為單細胞懸液，其分離方法多樣，一般用酶消化法，對于結構較復雜的組織多采用機械和酶組合的方式解離，比如毛囊單細胞的解離，對皮膚組織進行清洗消毒后，剪成0.5 cm×0.2 cm的小長條用dispase酶消化2 h，在體式顯微鏡下拔出單根毛囊置于培養(yǎng)皿中，再添加0.25%胰蛋白酶消化0.5 h后經(jīng)反復吹打、過濾、離心制備成單細胞懸液。之后再通過清洗、稀釋、利用微流控或者是FACS對細胞進行捕獲。為減少細胞聚團，在酶消化過程中可加入DnaseⅠ消化核酸而不損傷完整的細胞。

在細胞捕獲前，原代解離的細胞懸液會存在一定的雜質、較大的細胞碎片或者團塊，一般采用孔徑大于最大細胞直徑的細胞篩過濾，過濾兩次，較小的雜質可采用離心清洗來去除，離心過程中要使細胞匯集不能太緊實，而且上清液中的細胞要盡可能少，一般使用300×g，離心5 min［48］，由重力差細胞匯集到底部，雜質會漂浮在上清液中，棄上清后用含0.04%牛血清蛋白無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）進行重懸，為盡量減少剪切力對細胞的損傷，一般采用寬移液管對細胞進行重懸。細胞懸液制備好后，防止細胞放置時間長導致活率降低應盡快完成后續(xù)試驗。

2.2 單細胞的分離技術

近年來，眾多研究者對單細胞分離的方法進行持續(xù)的探究和改進，常用的單細胞分離技術有：有限稀釋法、熒光激活細胞分選、顯微操作技術、微流控技術和激光捕獲顯微切割技術（圖1）。

2.2.1 有限稀釋法 有限稀釋法（limiting dilution）多用于不同組織的干細胞或前體細胞的體外克隆分析，該方法將細胞懸液經(jīng)過一系列不同梯度稀釋，直至獲取單個細胞（圖1-a），憑借梯度稀釋計算，不能直觀的分選單細胞，這種方法對設備和操作的要求較小，操作簡單，成本低廉，但分離單細胞的成功率不高，對梯度稀釋的計算依賴性強，容易出現(xiàn)分離誤差或細胞丟失，耗時長，通量低，不能準確地過濾靶細胞［49-51］。

2.2.2 顯微操作法 顯微操作法（micromanipulation）主要在目標細胞稀少的情況下應用，利用顯微操作儀聯(lián)合顯微鏡觀察，操作者選擇一個特定的細胞，近距離移動口吸管，并通過對口吸管施加吸力來對單個細胞進行挑選，挑選出來再對其進行更深一步的研究（圖1-b）。顯微操作主要用于培養(yǎng)細胞系或者是從早期胚胎中分離單個細胞。這種方法對細胞的活性和狀態(tài)影響較小，成本低，但容易造成RNA降解、通量低、投入人力較多，不利于規(guī)?；瘧茫?2-53］。

2.2.3 熒光激活細胞分選技術 流式細胞術是一種通過單種或多種激光對PBS中的單個細胞或者離子快速分析的技術［54］（圖1-c）。流式細胞儀的熒光激活分選系統(tǒng)通過激光激發(fā)，被熒光抗體標記物標記的細胞經(jīng)過特定的激光束，再根據(jù)不同細胞接收的激光信號的偏轉情況捕獲單個細胞，該過程細胞懸浮液是通過流動細胞的壓力驅動的，細胞流迅速通過激光束被光激發(fā)，下游使用光學檢測器來捕獲細胞特定的信號而達到分選的目的。雖然實驗過程復雜，但是實驗技術已經(jīng)成熟，且有統(tǒng)一的標準可供參考。該技術的準確度和通量都很高，能快速檢測細胞的物理和化學參數(shù)；但是對懸浮細胞的數(shù)量要求較大（＞10 000），不適用于低豐度的細胞以及沒有表面標記抗體和未知的細胞的分選。

2.2.4 激光捕獲顯微切割技術 激光顯微切割技術（laser capture microdissection）是單細胞水平上對固體組織分析的有力工具，多用于從固定組織樣本中分離單個細胞［55］（圖1-d）?；驹硎窃陲@微鏡下使用UV（320-400 nm）激光選擇性地從冰凍或石蠟包埋組織切片熱塑膜的涂片上準確的切割單細胞，但是該技術成本高、通量低、精度有限。細胞核很容易被切割掉，導致一些染色體片段在操作過程中丟失，切割過程中可能涉及原生質體成份或相鄰細胞受損的細胞核，且分離過程中原始的RNA極容易降解，沒有全長分子用于反轉錄，RNA失去了它的完整性從而導致細胞群體出現(xiàn)偏差［56-57］。最近一項名為Smart-3SEQ［58］的新技術避免了該情況的出現(xiàn)，它結合了SMART［41］方法中的模板切換和Smartseq2［40］的優(yōu)化步驟采用 3SEQ［59］的 3′端表達定位法而產(chǎn)生一個非常簡單的程序。在3SEQ中，RNA在反轉錄之前被碎裂，這樣便消除了完整樣品和降解樣品之間的差異。反轉錄仍然是由錨定寡核苷酸（dT）引物啟動的，在每個轉錄物中，只有含poly（A）尾部起始的片段被測序。Smart-3SEQ與石蠟切片組織的相容性打開了大量存檔的臨床樣本，與LCM相結合，它允許對小細胞群體和原位分離的單個細胞進行前所未有的研究［58］。

2.2.5 微流控技術 近年來，基于液滴技術的微流控或者芯片設備被開發(fā)出來用于單細胞的分離與分析［60-61］（圖1-e）。隨著微流控裝置的引入，迅速使其成為分離細胞的首選技術，相對于先前使用方法，它需要的試劑體積更小。在微流控器件中，流體動力通量使得細胞在幾十到幾百微米的通道中被分離和處理，此外，微流控設備還可以自動處理一些下游的RNA反應，并允許測量和控制細胞外試劑濃度［62］。微流控技術（microfluidics）的基本原理是微液滴技術通常利用油相來剪切水相，形成表面活性劑穩(wěn)定的水液滴，兩種不混溶的流體在T型管中匯合時，來自水相的單細胞被包裹在液滴中，形成油包水的狀態(tài)［63］。該技術不僅可以在短時間內產(chǎn)生大量的油包水液滴，而且可以提供獨立的分離室進行單細胞分析，防止交叉污染。雖然基于液滴的單細胞分離取得了巨大的進展，但要保證油包水中不超過一個細胞的封裝仍然是一個挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的方法是根據(jù)泊松分布使用有限的稀釋，這將導致單細胞的占用率低，且會出現(xiàn)大量的空液滴。為了最大限度地提高單細胞液滴的比例，可以在乳化前通過慣性聚焦均勻間隔單細胞，將單細胞占用效率提高到80%［63］。綜上所述，基于液滴的技術具有成本低、通量高、制作簡單、規(guī)模大、速度快等優(yōu)點，但仍存在著單細胞含液滴率低、實時監(jiān)控不便的問題。

圖1 常用的單細胞分離技術部分引自[26]Fig. 1 Commonly used single cell isolation techniques Part cited from [26]

3 scRNA-seq不同測序方法比較

scRNA- seq方法可分為3個步驟進行：（1）反轉錄；（2）cDNA擴增；（3）測序文庫構建。反轉錄非常關鍵，scRNA-seq的效果很大程度上取決于這一步的效率。反轉錄過程中，約有10%-20%轉錄本被成功的反轉錄為cDNA［64］，這就導致一些低表達量的基因無法被檢測到，從而引入較高的技術偏差，也即技術噪音（technical noise）。單細胞測序中，常以盡量減少操作和利用單管反應來避免部分RNA損失，再用反轉錄法合成cDNA。除了基于引物設計的RNA測序DP-Seq［65］，為了防止捕獲核糖體RNA或轉移RNA占比較高的細胞RNA，一般使用poly（T）啟動來執(zhí)行反轉錄，使用這個方法，非多聚腺苷酸化編碼蛋白質的RNA不會被捕獲［66］。后來開發(fā)的SUPeR-seq彌補了這一缺陷，它被用于對單個細胞中的多聚嘌呤化和非多聚腺苷化RNA進行測序［67］。該方法使用具有固定錨定序列的隨機引物（AnchorX-T15N6）代替常用的寡核苷酸（DT）進行cDNA的合成。SUPeR-seq能檢測到單個細胞的多聚腺苷酸和非多聚腺苷酸RNA，且基因組DNA和rRNAs的污染可忽略不計［67］。但是該方法還沒有與除了Tang 2009以外的其他較廣泛使用的方法相比較。據(jù)后來報道稱MATQ-seq比Smart-seq2更為敏感和準確［68］。MATQ-seq提供了完整的基因覆蓋和允許檢測總共RNA，這是一個很大的改進，這種改進是基于MALBAC（多重退火和循環(huán)擴增循環(huán)）引物的使用。這些MALBAC引物包含27個常用序列，其后是5個隨機核苷酸，它們僅在3′端不同，分別為T20或G3/A3/T3，這樣大大提高了反轉錄和PCR擴增的效率。

反轉錄后，可以采用不同的方法合成第二鏈，一是SMART技術采用轉錄酶和M-MLV轉錄酶（小鼠白血病病毒逆轉錄酶）的一鏈轉換活性將模板轉換寡核苷酸作為下游PCR擴增的接頭［69］。SC3-seq［70］、STRT-seq［71］、Smart-Seq2［40］三個平臺都是使用PCR的方法進行擴增，PCR雖然是一種快速和廣泛使用的方法，但其缺點是會導致指數(shù)擴增，使得高表達的轉錄物最終在文庫中被過度表達［72］。此外，由于對不同轉錄種的擴增效率不同，PCR擴增會造成定量偏差，導致原始轉錄物豐度信息的丟失和非特異性轉錄片段的積累。為了避免這一情況的出現(xiàn)，CEL-seq2［73］和 MARS-Seq［27］利用 IVT 線性擴增來合成cDNA，通過在polyd（T）引物中加入T7啟動子，在第二鏈合成后進行IVT。互補RNAs要么被碎片化與3′端接頭連接，要么用隨機引物進行另一輪反轉錄以提高敏感性（CEL-seq2）。與PCR相比，IVT優(yōu)勢在于線性擴增，即使實驗中對低表達轉錄物的敏感性很低，它也不會以指數(shù)的形式消耗難以處理的序列。IVT比PCR工作強度更大，因為它需要對擴增的RNA進行額外的一輪的反轉錄，這通常會導致提前終止和富集3′端RNA片段的積累（強烈的3′端偏好性），從而無法檢測到樣本完整的轉錄組信息［74-75］。以上涉及的單細胞測序技術均列表比較（表1）。

表1 單細胞測序技術匯總Table 1 Summary of single cell sequencing techniques

目前，大多數(shù)測序都是使用NextEra試劑盒進行文庫構建，Illumina平臺進行測序，然而，擴增后得到的cDNA文庫與所有平臺都兼容，比如：SC3-seq被設計使用SOLiD系統(tǒng)進行測序［70］。最近使用唯一分子標識符（UMIs）來改善scRNA-seq建庫，它在反轉錄過程中對細胞內的每個單獨的mRNA分子標記上條形碼。從PCR復制標簽產(chǎn)生的排序讀數(shù)將具有相同的隨機條形碼序列。因此，如果考慮到實驗的初始RNA捕獲率（或效率），則給定細胞裂解物中轉錄本的拷貝數(shù)等于與映射到轉錄本的所有標簽相關聯(lián)的UMI的數(shù)量。使用UMIs時的一個重要考慮因素是，為了實現(xiàn)轉錄本豐度的準確量化，需要進行飽和測序。到目前為止，最廣泛使用的方法是在反應細胞裂解物中加入外部mRNA，這提供了關于分子輸入數(shù)量和觀察到的測序讀數(shù)之間的關系的信息。

4 scRNA-seq在HF發(fā)育研究中的應用

scRNA-seq對揭示組織、器官以及胚胎的發(fā)育過程的異質性具有很好的優(yōu)勢，HF的發(fā)育是一個非常復雜的過程，如果能夠通過高通量測序技術識別HF形態(tài)發(fā)生和周期性生長階段不同細胞亞群的基因表達譜，從基因表達調控的整體特征上研究HF形態(tài)發(fā)生和周期性生長階段的分子機制，篩選特異調控HF形態(tài)發(fā)生和周期性生長階段的調控元件或功能基因，從而揭示參與HF發(fā)育整個過程的細胞群體的異質性，將對畜禽品種的培育以及治療人類毛發(fā)疾病具有很好的理論指導。利用scRNA-seq對HF的研究最早在2016年，Joost等［19］利用scRNA-seq對成年小鼠HF進行測序，通過對休止期HF的1 422個單細胞進行了轉錄組學分析，聚類到25類不同轉錄水平的細胞亞群，解釋了表皮的轉錄異質性是由表皮分化和HF近-遠軸相關的基因表達模式的相互作用形成的，并揭示了形成表皮和HF的分化軌跡和空間特征。后來又運用scRNA-seq和單分子RNA熒光原位雜交（FISH）對小鼠生長期和休止期HF的分子解剖學進行研究，并得到56個表皮細胞和基質細胞群的基因表達譜和空間位置，并揭示了協(xié)調毛發(fā)生長的細胞類型和狀態(tài)的分子機制、潛在的祖細胞譜系分化、成纖維細胞的異質性和上皮-基質細胞的相互作用的細胞類型和狀態(tài)［20］。還有研究運用scRNA-seq對絨山羊胚胎期HF形態(tài)發(fā)生過程進行測序，鑒定到胚胎期HF形態(tài)發(fā)生過程中的主要細胞類型以及相關細胞的標記基因，構建了絨山羊真皮以及表皮細胞譜系在HF形態(tài)發(fā)生中的分化軌跡［77］。

4.1 發(fā)現(xiàn)新的細胞亞群

單細胞質控完成后，相同類型的細胞一般具有相似的表達譜。因此可以通過表達相似性對細胞進行聚類，從而將各細胞類型的細胞分離成獨特的細胞群。小鼠休止期HF單細胞測序研究人員［19］對其進行兩個水平的聚類，一水平的聚類分為外凸（outer bulge）、內凸（inner bulge）、毛囊上部（upper HF）、上皮基部（basal IFE）四大類，第二水平將這4類再進行亞聚類，經(jīng)再次聚類upper HF分為7個亞群，其中5個是已知的（uHF III-VII），發(fā)現(xiàn)兩個新的細胞群（uHF I and uHF I）［19］。新的亞群位于皮脂腺開口的周圍，通過Rbp1表達以及Defb6和Cst6高表達來區(qū)分。接著研究人員又利用單細胞RNA測序和單分子RNA FISH來對小鼠生長期和休止期皮膚進行了研究，作者鑒定出毛囊外根鞘（ORS）部分，并定義了3個細胞群。分別為Msx2 progency cluster（Msx2+）、Suprabasal outer layers cluster1（sbOL）、basal outer layers cluster2（bOL），其中后面兩個細胞群之前未報道過，在UMAP上，bOL和sbOL簇之間的表觀距離表明，這兩個細胞群體在成熟的生長期HF中是不通過中間狀態(tài)連接的。后面根據(jù)未剪接和剪接的mRNA的表達模式（RNA速率）來驗證了這兩類細胞身份的動態(tài)［78］，并發(fā)現(xiàn)bOL和sbOL在生長后期是不同的細胞群，因為RNA速率中并未發(fā)現(xiàn)兩個細胞簇之間有任何過渡跡象。這些新的發(fā)現(xiàn)揭示了ORS和內部HF層如何協(xié)調頭發(fā)的產(chǎn)生。

4.2 發(fā)現(xiàn)新的標記基因

由于技術的更新，發(fā)現(xiàn)很多保守的標記基因已經(jīng)不僅僅在特定組織中特異性表達，而是在不同類型的細胞中也能監(jiān)測到。在2015年，Sennett等［79］利用免疫熒光對不同類型的早期胚胎HF細胞進行了標記，通過流式分選，得到8個不同類型細胞群，經(jīng)RNA-seq測序建立了整個胚胎皮膚不同類型細胞的基因表達譜，并發(fā)現(xiàn)了許多標記基因。這是首次對HF形態(tài)發(fā)生過程中不同類型細胞的特異性分子進行描述。流式分選對表面抗原標記基因的保守性要求很嚴格，只有分選到高純度的目的細胞群才能反映其特異的基因表達譜。在當時還沒發(fā)現(xiàn)某些細胞群體在分化過程中會經(jīng)歷不同的階段，因此這樣得到的特異性分子保守性并不高。

后來，該團隊帶著DC特化的時間過程與祖細胞和信號傳遞之間的關系等問題進一步利用實時成像、流式分選、scRNA-seq和RNA-seq等方法根據(jù)特化過程中基因的動態(tài)變化和細胞在發(fā)育中的擬時序命運的分子時間推移，定義了從Fb到DC前體的細胞命運軌跡。DC特化過程總共經(jīng)歷了fibroblast、pre-DC、DC1以及DC2四個階段，但是在前面的研究中中間的分化階段是不存在的，技術的發(fā)展借助于單細胞測序，使得細胞之間的異質性得以展現(xiàn)，且還發(fā)現(xiàn)了新的標記基因，pre-DC階段的標記基因有Smad3、Lef1和Twist2；DC1階段特異性表達Foxd1、Prdm1、Sox18和Trps1；DC2階段特異性表達 Glis2、Foxp1、Alx4、Hey1 以及 Hes5［18，77］。葛偉［77］在研究絨山羊胚胎期HF形態(tài)發(fā)生過程中決定表皮與真皮細胞命運的基因表達轉錄譜中發(fā)現(xiàn)絨山羊與小鼠的DC細胞特化過程的基因表達譜與分化階段是一致的，都依次經(jīng)歷fibroblast、pre-DC、DC1以及 DC2 四個階段［18］。

scRNA-seq在IFE和HF的亞型分類研究中具有較高的分辨率，可以區(qū)分基底和漏斗處干細胞群的靜止和中間細胞狀態(tài)［80］。毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）位于HF永久部分的下部的隆起區(qū)［5-6］，在哺乳動物的毛發(fā)周期中參與自我更新、遷移和分化。近期，研究者采用單細胞測序闡述HFSCs在生長中期自我更新的異質性研究中，在主要類群中發(fā)現(xiàn)了一個由增殖細胞組成的亞群（Proli）不與任何凸起（Bu）或ORS種群聚集，并通過基因富集分析（GSEA）鑒定到新的標記基因，分別為 Bu新標記基因 Dmkn1、Crip1、Sostdc1、Ptn和Calml3；外根鞘上基底層（upORS-BL）新標記基因Gnmt、Abi3bp、Edn2、Angptl4和Igfbp4；外根鞘下基底層（lowORS-BL）新標記基因Tagln、Slc39a10、Acta2、Igfbp7和Rasl11a；外根鞘上基部（ORS-SB）新標記基因 Pthlh、Ctsc、Mgst1、Wfdc18、Cldn［81］。這些標記基因在未來可作為細胞消融、譜系追蹤和基因靶向研究的有力工具。

4.3 揭示HF發(fā)育過程的分化軌跡

單細胞基因表達研究使人們能夠對復雜的生物過程和高度異質性的細胞群體中涉及的轉錄調控進行進一步的認知。HF的形態(tài)發(fā)生是一個連續(xù)的過程，在發(fā)育過程中經(jīng)歷了許多的中間分化狀態(tài)，而這些中間分化狀態(tài)最好的展現(xiàn)就是分化軌跡圖，分化軌跡的出現(xiàn)有利于發(fā)現(xiàn)某些細胞亞群在階段分化過程中的特異性表達基因。在對細胞的異質性以及基因表達譜描述之后，利用細胞譜系關系構建分化軌跡圖，細胞間的變化軌跡圖能清晰的反應細胞隨著時間的變化過程，例如：在絨山羊胚胎期HF不同發(fā)育階段分化過程的細胞軌跡圖中表現(xiàn)出真皮譜系分化主要涉及DP和DC細胞的特化過程，而表皮細胞譜系分化主要涉及角化細胞、毛干細胞以及上皮細胞的特化過程［77］。細胞譜系關系在分化軌跡上呈現(xiàn)之后，就可以分析參與階段性分化過程的關鍵基因的表達趨勢，進而挖掘到新的標記基因。這樣也可以使我們對HF發(fā)育過程中細胞之間關系了解得更加透徹。

4.4 揭示HF發(fā)育過程中的關鍵調控因子

HF發(fā)育的譜系分化過程經(jīng)分化軌跡圖展示以后，將進一步探索整個命運獲取過程中的基因表達譜和參與轉錄調控的關鍵轉錄因子。上述的研究通過scRNA-seq分析建立從Fb到DC2的分化軌跡的偽時間排序后，單細胞擬時序分析發(fā)現(xiàn)在pre-DC命運獲取、DC1聚類和DC2毛發(fā)胚生長下降階段出現(xiàn)了3處基因上調的峰，這3處峰包含了許多的轉錄因子，比如在pre-DC階段，Lef1、Twist2、Smad3等顯著高表達。這表明這些因子在DC特化過程的pre-DC階段起到了關鍵作用。有報道稱，小鼠的Twist2基因敲除之后背部皮膚會出現(xiàn)毛發(fā)稀少，還伴隨著其他異常情況［82］，Lef1敲除則會導致胡須和背部毛囊無法形成［83］，為了驗證這一結果，研究人員通過FISH證實了Twist2基因只在pre-DC階段的mRNA中表達，而在隨后的DC1階段卻不表達，這一結果更加證實了這些轉錄因子在階段表達中起到的重要作用。到了DC1階段中間表達的轉錄因子包括 Prdm1、Trps1、Sox18、Tshz1和 Foxd1。這一點與前人相關研究報道一致，Trps1基因的突變與阿姆布拉斯綜合征（一種高度變性疾病，表現(xiàn)為毛囊數(shù)量異常增多）高度相關［84］。Sox18在小鼠中的突變會影響真皮乳頭的分化［85］，另外，在DC2階段有許多特異性高表達的轉錄因子，包括Hey1、Hes5、Glis2、Foxp1和Alx4。其中Foxp1是一個已知的在毛囊發(fā)育過程中維持HFSCs靜止（未分化）狀態(tài)的重要轉錄因子［86］。通過以上的研究可知，scRNA-seq對HF發(fā)育研究是一個非常有利的工具。

5 展望

近年來，scRNA-seq技術取得了很大進步，多種scRNA-seq平臺相繼問世。scRNA-seq的發(fā)展和創(chuàng)新很大程度上促進了單細胞轉錄組的研究，并為調控皮膚表皮和HF相關細胞的表達特異性和動態(tài)平衡提供了更大的清晰度。原位雜交聯(lián)合單細胞測序的方法為我們對HF的研究帶來很大的便利，通過這些方法可以讓我們對研究方向有更進一步的認識，利用單細胞測序技術解析哺乳動物HF形態(tài)發(fā)生以及生長發(fā)育的調控機制，對于治療人類毛發(fā)疾病也將有一定的借鑒意義。此外，隨著細胞條形碼和微流控技術的進步，scRNA-seq的通量得到顯著增加。同時，對固定和冷凍樣品的scRNA-seq方法最近被提出，這將極大地有利于高度異質性臨床樣品的研究。但是，目前可用的scRNA-seq方法仍然存在基因丟失率高的問題，這種情況下低表達的基因會在檢測過程中被遺漏。近些年隨著對HF單細胞由于分離技術限制性的克服，對HF單細胞水平的調控機制研究正在興起。我們相信不久的將來隨著技術的不斷發(fā)展，一定會為HF發(fā)育的分子調控機制和動力學會提供更科學、深入的解析。