姚瓊 全林發(fā) 徐淑 董易之 李文景 池艷艷 陳炳旭

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 廣東省植物保護新技術重點試驗室，廣州 510640）

“以蟲治蟲”是害蟲生物防治的主要內(nèi)容之一，天敵昆蟲在控制農(nóng)業(yè)蟲害和保證農(nóng)產(chǎn)品豐產(chǎn)中有不可替代的作用。叉角厲蝽 Eocanthecona furcellata屬于半翅目Hemiptera、蝽科Pentatomidae，國內(nèi)分布于四川、廣東、廣西、海南、福建和中國臺灣地區(qū)，國外分布于菲律賓、緬甸、泰國等國［1］。該蟲一年發(fā)生多代，2齡以上若蟲和成蟲對害蟲均有捕食能力，可捕食鱗翅目 Lepidoptera、鞘翅目 Coleoptera 和半翅目 Hemiptera 等多種農(nóng)作物害蟲，尤其對鱗翅目害蟲幼蟲表現(xiàn)出較好的控害能力，被認為是一種極具應用潛力的捕食性天敵昆蟲［1-2］。

章魚胺（OA）是無脊椎動物中一種非常重要的生物單體胺，在昆蟲體內(nèi)廣泛、大量存在于其中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周緣神經(jīng)系統(tǒng)［3］?；诠壷幸训玫降恼卖~胺受體的結構和信號傳遞差異，章魚胺受體分為 3 類 ：α-adrenergic-like（OctαRs），β-adrenergiclike（OctβRs） 和 octopatnine/tyramine（TyrRs）［4］。其中，OctβRs主要通過腺苷酸環(huán)化酶活性，誘導胞內(nèi) cAMP 的增加，激發(fā)蛋白激酶A的酶活性進而轉導信號［4-5］。章魚胺作為神經(jīng)遞質(zhì)與其受體結合共同參與調(diào)節(jié)昆蟲的嗅覺、產(chǎn)卵、運動、學習和記憶、免疫反應等多種生理功能［3，6-7］。

在害蟲綜合治理（IPM）中，使用農(nóng)藥控制靶標害蟲的同時也可能對天敵昆蟲產(chǎn)生毒害作用，使天敵對害蟲的控制作用降低。近年來，開展農(nóng)藥對天敵的毒性評價、減輕農(nóng)藥使用過程中對天敵的傷害和協(xié)調(diào)開展害蟲的化學防治和生物防治等逐漸成為IPM研究的熱點和重點。但是相關研究主要集中于農(nóng)藥亞致死效應對天敵的發(fā)育歷期、子代性比、凈生殖率和捕食功能等發(fā)育生殖和行為的影響，關于殺蟲劑對天敵昆蟲的亞致死作用的內(nèi)在分子機制報道較少［8-10］。本研究首次以捕食性天敵叉角厲蝽為實驗對象，在該蟲轉錄組數(shù)據(jù)結果基礎上鑒定了2個OctβRs基因，并對其全長進行了克??；在對其序列特征進行生物信息學分析之后，通過RT-qPCR技術測定了2個OctβRs基因的發(fā)育模式以及在亞致死劑量的高效氯氟氫菊酯和毒死蜱處理后的表達變化，以期為闡明OctβRs在叉角厲蝽應激反應中的生理功能研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

叉角厲蝽采集自廣東省農(nóng)業(yè)科學院白云基地蔬菜園，在溫度（25±1）℃，濕度RH（70±1）%、光周期14∶10（L∶D）的養(yǎng)蟲室中，以黃粉蟲Tenebrio molitor幼蟲飼養(yǎng)約3代以上。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉錄 收集3-5齡叉角厲蝽若蟲各1頭，混合用液氮研磨后，利用Trizol試劑提取總RNA，通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。采用PrimeScript RT Reagent 試劑盒（Takara）以提取的總RNA為模板反轉錄得到cDNA第1鏈，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 序列克隆與分析 以叉角厲蝽轉錄組（數(shù)據(jù)待發(fā)表）測序結果為基礎，從成功注釋的unigene中搜索章魚胺受體（Oct）基因序列，將其對應的蛋白序列與NCBI中的nr數(shù)據(jù)庫進行BLASTP，驗證是否屬于化學感受蛋白。使用Primer Premier 3.0軟件根據(jù)目的基因片段設計用于 EfOctβ1R 和 EfOctβ2R基因全長序列擴增和表達分析的引物（表1）。分別以2對特異性嵌套引物進行5′和3′RACE擴增。5′RACE 反應程序為 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s，65℃30 s，72℃ 1 min，33 個循環(huán)；72℃ 10min；4℃保存。3′RACE 反應程序為 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 1 min，33 個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。最后用DNAstar軟件將所得序列片段拼接為完整的序列。

表1 本研究中EfOctβ1R和EfOctβ2R克隆及實時熒光定量PCR所需引物列表Table 1 Primers for EfOctβ1R and EfOctβ2R cloning and qRT-PCR used in this study

蛋白分子量及等電點預測使用ExPASy 平臺中的 Compute pI/Mw（http：//expasy.org/tools/pi_tool.html），跨膜結構預測使用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）。 結 合 Ballesteros和Weinstein提出的方法，對兩條序列上的保守功能結構域和生物胺結合位點進行預測［11］。通過 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）的 Blast P功能完成氨基酸序列的同源性搜索，利用Clustal W軟件對序列進行多重比對的基礎上，采用MEGA 5.0 軟件中的鄰位相連法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，Bootrap為1 000次。所有從NCBI上獲取的序列信息如表2所示。

表2 系統(tǒng)發(fā)育分析所用蛋白信息Table 2 List sequence information used in phylogenetic analysis

續(xù)表Continuted

1.2.3 藥劑處理 前期分別開展了高效氯氟氰菊酯和毒死蜱對5齡叉角厲蝽若蟲的室內(nèi)生物活性測定，經(jīng)統(tǒng)計分析得高效氯氟氰菊酯和毒死蜱的LC50分別為4.52 mg/L和2.00 mg/L（未發(fā)表）。基于此，本研究通過藥膜法，以 4.52 mg/L高效氯氟氰菊酯和2.00 mg/L毒死蜱（以丙酮為介質(zhì)稀釋）處理的5齡叉角厲蝽若蟲作為處理組；以丙酮處理為對照組。分別于處理后12 h、24 h、36 h、48 h和60 h隨機收集處理組和對照組叉角厲蝽各1頭，液氮處理后-80℃保存?zhèn)溆?，每個樣本進行4個生物學重復。樣品總RNA的提取與反轉錄同1.2.1。

1.2.4 實 時 熒 光 定 量PCR 根 據(jù)EfOctβ1R 和EfOctβ2R基因序列用Primer Premier 3.0軟件設計RT-qPCR 特異性引物。利用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒（promega，麥迪遜，美國）進行RT-qPCR。其反應體系包括：10 μL GoTaq qPCR Master Mix，1 μL cDNA 模板，0.5 μL 正向引物，0.5 μL 反向引物，8 μL DEPC水。反應程序：95℃預變性2 min；95℃變性15 s；60℃退火60 s；40 個循環(huán)。以EfEF1a基因為內(nèi)參基因計算相對表達量，數(shù)據(jù)分析使用比較CT值方法分析［12］。每次RT-qPCR需要3次技術重復，并且每個樣本進行4個生物學重復。

2 結果

2.1 荔枝蒂蛀蟲EfOctβ1R和EfOctβ2R基因的克隆與序列分析

以叉角厲蝽cDNA為模板進行PCR擴增，得到 EfOctβ1R 和 EfOctβ2R的基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）長度為1 245和1 230 bp，分別編碼414和409個氨基酸（表3）。其蛋白分子量分別為47.34和46.67 kD，二者等電點均大于8，偏堿性，親水系數(shù)為正值，二者均為疏水性蛋白。

表3 叉角厲蝽的章魚胺受體EfOctβ1R和EfOctβ2R信息Table 3 List of EfOctβ1R and EfOctβ2R in Eocanthecona furcellata

通過TMHMM預測發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白序列包含有7個跨膜結構域、3個胞外環(huán)、3個胞內(nèi)環(huán)、胞內(nèi)C端和胞外N端，屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。與其他物種同源基因的多序列比對發(fā)現(xiàn)，EfOctβRs蛋白序列在跨膜區(qū)域保守性較高，EfOctβ1R 和 EfOctβ2R 第 2個和第 3個跨膜結構之間，具有高度保守的兩個半胱氨酸殘基（圖1，圖2）。EfOctβ1R 在跨膜結構 3（TM3）后有典型的G蛋白偶聯(lián)受體保守的DRY結構域，EfOctβ1R 和EfOctβ2R的跨膜結構7（TM7）上具有NP（L/I）IY結構，均是β-adrenergic-like章魚胺受體中高度保守結構，也是配體誘導內(nèi)在轉化所必需的結構［5，11］。此外，二者序列中存在蛋白激酶C、配體結合位點和糖基化位點等高度保守結構域，跨膜區(qū)域的保守性均大于非跨膜區(qū)域，并且跨膜域TM5和TM6間的胞內(nèi)三環(huán)是最大的。

圖1 叉角厲蝽EfOctβ1R與褐飛虱、赤擬谷盜、果蠅同類蛋白氨基酸序列比對分析Fig. 1 Amino acid sequence alignment of EfOctβ1R in E. furrellata and orthologous receptors from Nilaparvata lugens（NlOctβ1R，ATY68966.1），Tribolium castaneum（TcOctβ1R，NP_001280514.1）and Drosophila melanogaster（DmOctβ1R，NP_001163690.1）

圖2 叉角厲蝽EfOctβ2R與跳蚤、褐飛虱、赤擬谷盜同類蛋白氨基酸序列比對分析Fig. 2 Amino acid sequence alignment of EfOctβ2R and orthologous receptors from Cimex lectularius（ClOctβ2R，XP_014254146.1），Nilaparvata lugens（NlOctβ2R，ASA47149.1）and Tribolium castaneum（TcOctβ2R，NP_001280501.1）

2.2 基于叉角厲蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R氨基酸序列進化樹的構建與同源性分析

基于已報道的其他昆蟲種類的同類氨基酸序列基因信息，通過構建系統(tǒng)發(fā)育關系來進一步探明EfOctβ1R 和 EfOctβ2R的進化關系。結果顯示，所有選中的昆蟲章魚胺受體蛋白形成Octβ1R和Octβ2R兩個明顯的分支（圖3）。與EfOctβ1R同源性最高的同類蛋白為：褐飛虱Nilaparvata lugens NlOctβ1R和 臭 蟲 Cimex lectularius ClOctβ1R；與 EfOctβ2R 同源性最高的同類蛋白為：茶翅蝽Halyomorpha halys HhOctβ2R、長紅獵蝽 Rhodnius prolixus RpOctβ2R 和臭蟲 Cimex lectularius ClOctβ2R。

圖3 EfOctβ1R和EfOctβ2R與其他昆蟲同類蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig. 3 Phylogenetic analyses of EfOctβ1R and EfOctβ2 R and their homologs in other insects

2.3 表達模式

在叉角厲蝽整個發(fā)育周期的不同發(fā)育階段中，均可檢測到EfOctβRs基因，但在不同發(fā)育階段該基因的表達水平有所差異，二者在叉角厲蝽成蟲期均有較高量表達。EfOctβ1R基因在叉角厲蝽整個若蟲期均有所表達，但在3齡若蟲期表達最低，僅為卵期表達的0.35倍，在1齡若蟲期表達較高，可為卵期表達量的4.90倍；該基因在成蟲期表達水平最高，可達卵期表達量5倍以上（圖4-A）。EfOctβ2R基因表達模式區(qū)別于EfOctβ1R基因，在成蟲期表達水平最高，可為卵期的1.97和2.45倍；而在整個若蟲期相對表達量均低于卵期表達量，尤其是4齡若蟲期呈最低表達水平（圖4-B）。

圖4 叉角厲蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R基因表達模式Fig. 4 Expression pattern of EfOctβ1R and EfOctβ2 R in E.furcellata

2.4 亞致死劑量藥劑處理對叉角厲蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R基因表達量影響

以亞致死劑量高效氯氟氫菊酯和毒死蜱處理叉角厲蝽5齡若蟲，利用RT-qPCR 檢測EfOctβ1R和EfOctβ2R基因在處理后5個時間點的表達量變化。結果顯示（圖5），與空白對照組相比，亞致死劑量的高效氯氟氫菊酯處理后24 h開始，EfOctβ1R和EfOctβ2R基因的相對表達量均陡然上升。在高效氯氟氫菊酯處理后 24 h時，EfOctβ1R 和 EfOctβ2R基因表達上升可高達29和19倍，EfOctβ1R和EfOctβ2R基因在該藥劑處理后24 h、36 h和60 h的表達上升倍數(shù)之間存在顯著性差異。與高效氯氟氫菊酯處理組相似，亞致死課題毒死蜱處理試蟲后36 h時，EfOctβ1R和EfOctβ2R基因的相對表達量上升高達23和12倍，而且在該藥劑處理后36 h和60 h，EfOctβ1R和EfOctβ2R表達上升倍數(shù)之間有顯著性差異，說明這兩類化學藥劑能影響叉角厲蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R的表達，二者表達變化不同可能與其不同生理功能相關。

圖5 亞致死劑量的高效氯氟氫酯酯和毒死蜱處理后叉角厲蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R基因表達量變化Fig. 5 Change in the gene expressions of EfOctβ1R and EfOctβ2R in E. furellata treated with sublethal doses of efficient r-cyhalothrin and chlorpyrifos

3 討論

生物胺是動植物體內(nèi)一種弱堿性低分子量含氮化合物，由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成［3，7，13］。該類物質(zhì)是一種神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)，通過血淋巴以神經(jīng)激素的形式作用于靶標器官或組織，對維持生物體的正常生理生化過程及行為有重要意義［7，13］。本研究利用轉錄組測序和RACEPCR的方法，從叉角厲蝽中克隆出了2個EfOctβRs基因全長序列，為首次從厲蝽屬昆蟲中克隆同類蛋白序列。自Maqueira等［4］從果蠅中鑒定出了第一個昆蟲β-adrenergic-like章魚胺受體基因起，生物學家們先后從家蠶Bombyx mori［14］、二化螟Chilo suppressalis［15］、 橘 小 實 蠅 Bactrocera dorsalis［16］等多種昆蟲中分離鑒定出同類基因。生物信息學分析表明，EfOctβ1R和EfOctβ2R2存在其他昆蟲章魚胺受體預測和證實的磷酸化位點、糖基化位點及配體結合位點等保守的結構域，二者跨膜域TM6上的FxxxWxP序列后緊挨著兩個苯丙氨酸殘基（FF），該結構是生物胺類受體所特有的結構，均對維持蛋白特有功能有重要意義。據(jù)報道，Octβ1R和Octβ2R2在桔小實蠅和二化螟的卵期、幼蟲期、蛹期及成蟲期蟲體內(nèi)均有所表達［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，EfOctβ1R和EfOctβ2R基因在叉角厲蝽的卵期、若蟲期和成蟲期呈現(xiàn)不同模式的表達。其中Octβ2R在卵期表達要高于若蟲期，而EfOctβ1R則相反，可能與二者在卵期和若蟲期的功能不同有關；此外，EfOctβ1R和EfOctβ2R在叉角厲蝽3齡若蟲期和4齡若蟲期均有一個低量表達，但二者具體生理功能還待進一步研究。

在內(nèi)外環(huán)境不良刺激下，生物體為了應對可能危及體內(nèi)平衡的各類脅迫，會產(chǎn)生生理或行為上的壓力反應［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)，高溫、饑餓和高糖刺激下，黑腹果蠅Drosophila virilis［19］和意大利蜜蜂Apis mellifera［20］體內(nèi)章魚胺濃度及活性顯著改變；高密度飼養(yǎng)地中海蟋蟀Gryllus bimaculatus［21］和黏蟲Mythimna separate［22］體內(nèi)章魚胺濃度增加。研究認為在不同逆境狀態(tài)下，昆蟲體內(nèi)章魚胺濃度變化，與其應激反應中的生理生化變化及行為調(diào)控密切相關?；瘜W農(nóng)藥是昆蟲受到的最普遍的外界脅迫刺激之一，Hirashima等［23］證實多種殺蟲劑處理美洲大蠊Periplaneta americana后，可引起蟲體內(nèi)章魚胺的含量顯著上升。但是Rachel等［24］證實雙甲脒僅能輕微引起意大利蜜蜂血淋巴中章魚胺含量上升?？梢姴煌饔脵C制的化學藥劑對昆蟲章魚胺含量影響結果不同。近期研究發(fā)現(xiàn)，化學藥劑不僅影響昆蟲章魚胺含量和活性，也會引起其受體的表達水平變化，但是相關研究報道屈指可數(shù)。菊酯類、煙堿類和殺蟲肼類殺蟲劑均可顯著提高埃及伊蚊Aedes aegypti 章魚胺受體表達水平，擾亂其代謝水平起到殺蟲作用［25］?；奖ヮ惡屯惢衔锟赡芡ㄟ^影響蕈蚊Bradysia procera 章魚胺受體表達水平，最終起到殺蟲和殺卵作用［26］。本研究同樣證實了亞致死劑量殺蟲劑脅迫后會引起昆蟲體章魚胺受體表達水平的變化。用亞致死劑量的高效氯氟氫菊酯和毒死蜱處理叉角厲蝽后，蟲體2個EfOctβRs基因均呈現(xiàn)相對表達量陡然上升，隨后表達變化倍數(shù)減少的變化趨勢，而且2種藥劑作用下EfOctβ1R和EfOctβ2R呈現(xiàn)不同程度的變化，其變化區(qū)別可能與2種殺蟲藥劑作用機制不同相關。其中，高效氯氟氫菊酯作用下2個EfOctβRs最大變化出現(xiàn)于藥劑作用后24 h，早于毒死蜱處理組（36 h），可能由于對叉角厲蝽而言，高效氯氟氫菊酯藥效快于毒死蜱。

使用化學藥劑防治害蟲的同時，天敵昆蟲不可避免遭受藥劑毒害?；瘜W殺蟲劑對天敵昆蟲脅迫研究在協(xié)調(diào)害蟲化學和生物防治中意義重大。殺蟲劑對天敵昆蟲的發(fā)育、行為及生殖影響研究及相關機制是IPM研究熱點之一。本研究首次利用捕食性天敵昆蟲叉角厲蝽為研究對象，對叉角厲蝽2個EfOctβRs基因進行了克隆及序列分析，并且在其序列特征及表達模式分析結果的基礎上，以常用殺蟲劑高效氯氟氫菊酯和毒死蜱為處理藥劑，對亞致死劑量化學藥劑作用后厲蝽中EfOctβRs基因表達情況進行了解析，結果證明EfOctβRs可能參與叉角厲蝽在殺蟲劑脅迫下的應激過程，后續(xù)可通過RNAi或CRISPR基因編輯等技術在活體水平確定該類蛋白在天敵昆蟲應激過程中的相關功能，為該蟲在生物學防治中的應用提供理論支撐。

4 結論

叉角厲蝽2個EfOctβRs基因所編碼的蛋白包含有7個跨膜結構域和其他昆蟲章魚胺受體證實的磷酸化位點、糖基化位點及配體結合位點等保守的結構域，屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。EfOctβ1R 和 EfOctβ2R基因在叉角厲蝽的卵期、若蟲期和成蟲期呈現(xiàn)不同模式的表達，對亞致死劑量高效氯氟氫菊酯和毒死蜱有強烈的響應，在叉角厲蝽的化學藥劑脅迫響應中行使相應功能。