徐建東，易娟娟，吳婉靜，宋海林，陳亞珠，張曉燕，陶曉琰，李國文△

（1.上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院藥劑科，上海 200434； 2.上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 200434）

阿司匹林、氯吡格雷為常用抗血小板藥物，而華法林為常用抗凝藥物，根據(jù)病情需要單獨(dú)應(yīng)用其中1種，二聯(lián)甚至三聯(lián)療法的治療方案常見[1]。多數(shù)患者在抗栓治療過程中獲益，但由于藥物反應(yīng)個(gè)體差異、臨床療效差異大、不良反應(yīng)頻發(fā)、病情反復(fù)等原因，給醫(yī)務(wù)人員和患者帶來嚴(yán)重困擾。研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性影響華法林的劑量和療效[2]。2010年，美國食品藥物管理局（FDA）發(fā)布了關(guān)于氯吡格雷藥物包裝上的盒裝警告，要求檢測藥物基因型以明確患者氯吡格雷的代謝變化、不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)、基因多態(tài)性對氯吡格雷的代謝及臨床影響。阿司匹林抵抗發(fā)生率存在明顯的種族差異，基因多態(tài)性在阿司匹林抵抗中起著重要作用，主要集中在血小板表面糖蛋白Ⅲa（GPⅢa）、血小板內(nèi)皮聚集受體1（PEAR1）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1（PTGS1）等[3]。在此，通過分析群體藥物相關(guān)單核苷酸的多態(tài)性，為臨床醫(yī)師的抗凝用藥提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科2017年1月至2018年12月使用硫酸氫氯吡格雷片（賽諾菲制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20130083）、阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準(zhǔn)字J20130087）、華法林鈉片（上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H31022123）治療并進(jìn)行相關(guān)基因檢測的住院患者169例。于醫(yī)院信息管理系統(tǒng)中收集患者的性別、年齡、民族、用藥情況等相關(guān)信息。

1.2 方法

采用熒光染色原位雜交檢測法對患者血樣的藥物相關(guān)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢驗(yàn)，儀器為Fluotec 48E型微量熒光檢測儀（西安天隆科技有限公司）。

熒光分子雜交測序：1）EDTA抗凝管采集到的臨床全血樣本，上下顛倒混勻。取若干1.5 mL離心管，并在管蓋上編寫序號，與抗凝管上的編號一致。2）采用H1620-W型水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)（湖南湘儀公司），于1.5 mL離心管中加入1.2 mL 1×NH4Cl預(yù)處理液。3）取150μL混勻的臨床全血，加入對應(yīng)編號的1×NH4Cl預(yù)處理液離心管中。4）上下顛倒10次，室溫靜置5 min，此時(shí)1×NH4Cl裂解紅細(xì)胞。血樣與1×NH4Cl混勻，液體顏色會逐漸變?yōu)槌吻宓募t色。5）室溫700 g離心5 min，將上層透明紅色液體吸干凈，注意避免吸走管底白細(xì)胞。6）加入1mL1×NH4Cl徹底重懸白細(xì)胞，室溫700 g離心5min，將上層液體吸干凈，注意避免吸走管底白細(xì)胞。7）向富集有白細(xì)胞的離心管中加入50μL核酸純化保存液，反復(fù)吹打混勻。8）上機(jī)檢測時(shí)加入1.5μL處理液，處理后樣本置測序反應(yīng)通用試劑盒中選擇相應(yīng)溫度檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般資料

169例患者的平均年齡（77.82±10.57）歲；男67例（39.64%），女102例（60.36%）；均為漢族；使用華法林56例，氯吡格雷125例，阿司匹林83例。

2.2 基因型與表現(xiàn)型

2.2.1 華法林

VKORC1分型：GG2例，GA 11例，AA 43例，A等位基因頻率為86.61%；CYP2C9分型：AA 49例，AC 7例，C等位基因頻率為6.25%。詳見表1。

表1 3種抗凝藥物基因型頻率分布[例（%）]Tab.1 The genotype frequency distribution of three anticoagulant drugs[case（%）]

2.2.2 氯吡格雷

PON1分型：GG 48例，AG 59例，AA 18例，G等位基因頻率為62.00%；CYP2C19*2分型：GG48例，GA51例，AA 26例，A等位基因頻率為41.20%；CYP2C19*3分型：GG 113例，GA 12例，A等位基因頻率為4.80%；CYP2C19*17分型：CC 123例，CT 2例，T等位基因頻率為0.80%；ABCB1分型：TC 58例，CC 51例，TT 16例，C等位基因頻率為64.00%。CYP2C19*2，CYP2C19*3，CYP2C19*17等位基因可導(dǎo)致人群出現(xiàn)慢代謝型、中間代謝型、快代謝型和超快代謝型4種表型。詳見表1和表2。

表2 服用氯吡格雷患者的CYP2C19基因型及表現(xiàn)型分布（n=125）Tab.2 CYP2C19 genotype and phenotype distribution of patients treated with clopidogrel（n=125）

2.2.3 阿司匹林

GPⅢa PLA2分型：TT 80例，TC 3例，C等位基因頻率為1.81%；PEAR1分型：GG32例，GA 37例，AA 14例，A等位基因頻率為39.16%；PTGS1分型：AA 83例，G等位基因頻率為0；GP1BA分型：CC 75例，CT 7例，TT 1例，T等位基因頻率為5.42%；谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）分型：AA 49例，AG 26例，GG 8例，G等位基因頻率為25.30%。PTGS1基因多態(tài)性的G等位基因頻率為0，因此，無法計(jì)算χ2值，其余基因型的頻率未顯著偏離Hardy-Weinberg均衡。詳見表1。

3 討論

3.1 華法林用藥相關(guān)基因檢測

華法林通過抑制維生素K依賴性凝血因子（Ⅱ，Ⅶ，Ⅸ，Ⅹ）的活化來介導(dǎo)抗凝作用[4]。不同個(gè)體之間維持劑量存在較大差異，主要與VKORC1和CYP2C9有關(guān)。VKORC1為華法林的作用靶點(diǎn)，是維生素K代謝過程中的限速酶，決定了維生素K環(huán)氧還原酶的活性[5]，控制維生素K依賴性凝血因子生成。突變AA型患者的VKORC1酶表達(dá)水平下降，維生素K循環(huán)受限。由表1可知，華法林VKORC1-1639 AA型患者43例（76.79%）需使用小劑量，GA型11例（19.64%）需減少劑量。華法林經(jīng)CYP2C9代謝失活，CYP2C9具有高度多態(tài)性，CYP2C9*3在亞洲人中更普遍[6]，CYP2C9基因突變導(dǎo)致華法林在體內(nèi)蓄積，應(yīng)減量，VKORC1和CYP2C9基因檢測結(jié)果用于起始劑量和維持劑量的計(jì)算。文獻(xiàn)[7-8]顯示，華法林的維持劑量存在民族差異。華法林的維持劑量隨著VKORC1的變異而降低，純合子VKORC 1變異攜帶者在白種人、西班牙人和亞洲人中分別為15%，15%，79%。因此，華法林用量白種人最高，亞洲人最低。國際華法林遺傳藥理學(xué)協(xié)會（IWPC）根據(jù)不同種族人群的大量數(shù)據(jù)提煉遺傳藥理學(xué)的劑量計(jì)算法則，應(yīng)用于華法林劑量的調(diào)整[9]。VKORC1-1639 AA型在中國人群中占多數(shù)，可能是中國人華法林應(yīng)用劑量偏低的原因。2007年，PDA已把遺傳藥理學(xué)的信息增加到華法林產(chǎn)品標(biāo)簽中[10]。

3.2 氯吡格雷用藥相關(guān)基因檢測

氯吡格雷作為一種前體藥物，經(jīng)口服后在小腸中的吸收受到ABCB1基因編碼的P-糖蛋白調(diào)控，85%在血液中轉(zhuǎn)化為非活性的氯吡格雷酸并被代謝掉，余下15%在肝臟中通過細(xì)胞色素P450酶、PON1酶等催化轉(zhuǎn)化為活性代謝物，選擇性地、不可逆地與血小板中的P2Y12受體結(jié)合，抑制血小板聚集[11]。在氯吡格雷轉(zhuǎn)化為活性代謝物的過程中，細(xì)胞色素P450酶系起著非常重要的作用。細(xì)胞色素P450在單加氧酶家族中屬高度多態(tài)性酶系，基因多態(tài)性與酶的活性緊密相關(guān)。其中主要以CYP2C19*2在基因介導(dǎo)的氯吡格雷反應(yīng)中占主導(dǎo)作用。CYP2C19的表型多態(tài)性具有明顯的種族差異，白種人慢代謝型發(fā)生率僅為3%，津巴布韋黑種人慢代謝型發(fā)生率僅為4%，中國人慢代謝型發(fā)生率僅為15%～17%[12]。本研究中，對125例服用氯吡格雷的患者進(jìn)行CYP2C19*2，CYP2C19*3和CYP2C19*17等位基因檢測，其中超快代謝型為0，快代謝為32.80%，中間代謝為43.20%，慢代謝為24.00%。對于中間代謝型和慢代謝型患者在使用氯吡格雷時(shí)應(yīng)注意氯吡格雷抵抗。2015年實(shí)行的《藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測技術(shù)指南（試行）概要》[13]建議CYP2C19*1/*1基因型個(gè)體應(yīng)用氯吡格雷有效，可常規(guī)使用；CYP2C19*2/*3基因型個(gè)體對氯吡格雷療效降低，建議更換為普拉格雷或替卡格雷；CYP2C19*2/*3突變型純合子個(gè)體應(yīng)用氯吡格雷效果差，建議換用普拉格雷或替卡格雷。同時(shí)，CYP2C19的活性受多種藥物影響，質(zhì)子泵抑制劑（PPI）作為該酶的底物可競爭性地抑制氯吡格雷的代謝。國家藥品監(jiān)督管理局藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)（第55期）《警惕質(zhì)子泵抑制劑的骨折、低鎂血癥風(fēng)險(xiǎn)以及與氯吡格雷的相互作用》及文獻(xiàn)[14-15]顯示，某些PPI會降低氯吡格雷的療效，患者血栓不良事件增加。其中，奧美拉唑?qū)YP2C19具有高度親和力，大大降低氯吡格雷療效，因而抗血小板作用影響最強(qiáng)，泮托拉唑具有獨(dú)特的Ⅱ相代謝途徑，所以對氯吡格雷影響最弱。

3.3 阿司匹林用藥相關(guān)基因檢測

3.3.1 阿司匹林抵抗相關(guān)基因

阿司匹林抵抗通常是指阿司匹林不能發(fā)揮預(yù)期的生物學(xué)作用或不能預(yù)防栓塞性疾病，發(fā)生率為5.5%～60.0%[16]?；蚨鄳B(tài)性在阿司匹林抵抗中起著重要作用，主要集中在GPⅢa，PEAR1，PTGS1等。

GPⅡb/Ⅲa是血小板表面的受體蛋白，與vWF和纖維蛋白原均可引發(fā)血小板的聚集，是血小板激活的最后環(huán)節(jié)。其中，GpⅢa是一種多型蛋白，最常見的等位基因亞型是PLA1和PLA2。PLA2位點(diǎn)的外顯子2位置的T突變?yōu)镃，導(dǎo)致GPⅢa蛋白的第33個(gè)位點(diǎn)從脯氨酸變?yōu)榱涟彼?。體外研究表明，PLA2基因突變可增加血小板表面的GPⅡb/Ⅲa對纖維蛋白原的反應(yīng)，增加血小板聚集，這是導(dǎo)致阿司匹林抵抗的主要原因[17]。

PEAR1是參與血小板激活途徑的一種橫跨細(xì)胞膜的分子，磷酸化作用可促進(jìn)血小板聚集。研究證明，中國人群中PEAR1的野生G基因的基因頻率為0.61%，突變A基因的基因頻率為0.39%[18]。突變基因型AA或AG的患者使用阿司匹林（或結(jié)合氯吡格雷）時(shí)的心肌梗死發(fā)生率和死亡率會增高。

阿司匹林主要通過抑制環(huán)氧合酶1（COX-1）和環(huán)氧合酶2（COX-2）發(fā)揮藥理作用，可使COX-1位點(diǎn)甲基化而使該酶失活，阻斷血小板聚集反應(yīng)。阿司匹林對COX-2的抑制作用遠(yuǎn)低于COX-1，且有研究表明主要是編碼COX-1的PTGS1基因多態(tài)性與發(fā)生阿司匹林抵抗相關(guān)。LEP?NTALO等[19]以血小板聚集率為標(biāo)準(zhǔn)定義阿司匹林抵抗，發(fā)現(xiàn)60%的阿司匹林抵抗患者均攜帶突變位點(diǎn)G，而無阿司匹林抵抗者僅有17%攜帶突變基因。

由表1可知，阿司匹林PTGS1基因無患者攜帶突變位點(diǎn)G，均為AA野生型。GPⅢa PLA2等位基因由T突變?yōu)镃有3例，突變頻率為3.61%。PEAR1基因AA型14例，突變頻率為16.87%；GA型37例，突變頻率為44.58%。應(yīng)注意患者發(fā)生阿司匹林抵抗的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3.2 其他相關(guān)基因

MATSUBARA等[20]首次發(fā)現(xiàn)，GP1BA基因145Thr突變?yōu)镸et（即5792 C＞T）會增強(qiáng)患者對阿司匹林抗血小板的敏感性。SHIOTANI等[21]研究發(fā)現(xiàn)，GSTP1基因的G位點(diǎn)可能與腸道出血的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，GG型和AG型使用阿司匹林消化道出血風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究結(jié)果顯示，GP1BA基因CT型7例，突變頻率為8.43%，對阿司匹林抗血小板的敏感性增強(qiáng)。提示用藥過程中應(yīng)關(guān)注患者的出血風(fēng)險(xiǎn)。GSTP1基因GG型8例，突變頻率為9.64%；AG型26例，突變頻率為31.33%?？梢?，此基因類型患者在使用阿司匹林時(shí)應(yīng)密切關(guān)注消化道出血風(fēng)險(xiǎn)。

3.4 小結(jié)

華法林的出血風(fēng)險(xiǎn)，氯吡格雷和阿司匹林的抵抗，均會導(dǎo)致患者心血管不良事件的發(fā)生率大大增加。除了疾病和依從性因素外，相關(guān)基因突變是造成藥物出血或抵抗的重要因素。基因型檢測可為臨床提供患者藥物相關(guān)的遺傳信息，結(jié)合臨床實(shí)際和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，對實(shí)行個(gè)體化治療具有重要意義。