閆學(xué)春，欒培賢，何立川

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

mstn（Myostatin，肌肉生長抑制素）基因是動(dòng)物肌肉生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控基因，敲除或抑制其表達(dá)，可使動(dòng)物的肌肉快速大量增長。動(dòng)物肌肉發(fā)育不僅依靠激素調(diào)節(jié)，某些組織特異性效應(yīng)因子也影響肌肉的發(fā)育。肌肉生長抑制素是目前所知最強(qiáng)的肌肉生長抑制因子，它通過抑制成肌細(xì)胞的增殖而發(fā)揮作用[1,2]。Myostatin 抑制肌肉生長發(fā)育的功能在“比利時(shí)藍(lán)?！焙汀氨说旅商嘏！敝械玫搅蓑?yàn)證，他們是2個(gè)經(jīng)過長期遺傳選育得到的雙肌牛品種?！氨壤麜r(shí)藍(lán)?！本哂惺謴?qiáng)壯的骨骼肌，其骨骼肌數(shù)量是其他品種牛的4 倍；而在“彼德蒙特?！敝袡z測到2 個(gè)點(diǎn)突變，導(dǎo)致Myostatin 功能全部或幾乎全部喪失[3-5]。以上研究結(jié)果表明，肉牛的“雙肌”現(xiàn)象是由于在骨骼肌細(xì)胞中缺少M(fèi)yostatin 蛋白抑制作用的緣故。自Mcpherron 等發(fā)現(xiàn)小鼠mstn 基因以來[6]，相繼克隆了真鯛（Pagrosomus major）[7]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[8]、松江鱸（Trachidermus fasciatus）[9]、淇河鯽（Carassius auratus）[10]、加州鱸（Micropterus salmoides）[11]（Elopichthys bambusa）[12]、草魚（Ctenopharyngodon idella）[13]、鱖（Siniperca chuatsi）[19]、斑鱖（S.scherzeri）[14]、鯉（Cyprinus carpio）[15]、斑馬魚（Danio rerio）[16]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[17]、大西洋鮭（Salmo salar）[18]和莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）[20]等魚的mstn 基因，說明魚類中mstn 基因分布廣泛，且都參與了肌肉的生長和發(fā)育調(diào)控。

RNA 干擾（RNA interference,RNAi）是由小片段siRNA（Small interfering RNA）介導(dǎo)的誘導(dǎo)同源mRNA 降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)抑制的現(xiàn)象[21]。siRNA是RNA 干涉的中間產(chǎn)物，在靶序列的識(shí)別上具有高度特異性，只降解與其序列互補(bǔ)配對(duì)的mRNA[22]。本研究以鯉mstn mRNA 為靶序列，篩選有效抑制鯉Myostation 基因的siRNA 分子，構(gòu)建siRNA 質(zhì)粒pzu6p-siMSTN，目的是將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)到鯉細(xì)胞內(nèi)，讓轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抑制鯉mstn 基因表達(dá)或阻斷與該基因相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。而具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA 能夠增加阻斷基因的表達(dá)時(shí)間[ 23 ]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)用受精卵取自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)場性成熟的鯉親魚。轉(zhuǎn)基因鯉的飼養(yǎng)管理、樣品處理和檢測程序等均與對(duì)照組相同。

1.2 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒pzu6p-siMSTN 構(gòu)建

在鯉mstn 基因的CDS 區(qū)（GenBank:GQ214770.1）上，通過金斯瑞公司的設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了一條含有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的干涉片段（含有BamH Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位點(diǎn)），長度為70 bp。合成的干涉片段構(gòu)建在puc57載體上，為puc57-siMSTN。

用限制性內(nèi)切酶Ase Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切PEGFP-C1 質(zhì)粒載體，切除質(zhì)粒上的CMV 啟動(dòng)子、egfp 表達(dá)區(qū)域和sv40 終止子，獲得3 100 bp 的框架結(jié)構(gòu)，獲得帶有Ase Ⅰ和Mlu Ⅰ粘性末端的啟動(dòng)子片段。通過T4 DNA 連接酶連接。獲得質(zhì)粒pzu6p-siRNA。

用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Mlu Ⅰ分別雙酶切puc57-siMSTN 和pzu6p-siRNA，經(jīng)T4 連接酶連接，并轉(zhuǎn)入top 10 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，測序驗(yàn)證獲得pzu6p-siMSTN（鯉U6 啟動(dòng)子干涉載體）轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒（圖1）。

圖1 鯉U6 啟動(dòng)子干涉載體圖譜Fig.1 The transgenic donor plasmid of U6 promoter for common carp Cyprinus carpio

1.3 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒DNA 的提取

采用堿法裂解法提取轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒。提取單個(gè)菌落接種到含有卡娜霉素的LB 培養(yǎng)基中，37℃強(qiáng)烈震蕩培養(yǎng)過夜，離心，向沉淀物中依次加入50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉、25 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷、溶菌酶4 mg/mL、0.2 mol/L 氫氧化鈉、1%十二烷基硫酸鈉、和醋酸鉀等溶液；離心，向上清液中加入等體積酚/氯仿，混合，離心，向上清液中加入2 倍體積無水乙醇沉淀，再用70%乙醇清洗，離心，加RNA 酶和TE 溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 外源基因?qū)?/h3>

在6 月繁殖季節(jié)，采用腦垂體和類似物的混合物人工催產(chǎn)，分別采集鯉卵子和精液，放入4℃冰箱中備用。每次注射時(shí)，取少量的卵子和精液授精，讓受精卵分散粘附在培養(yǎng)皿上，用國產(chǎn)可三維移動(dòng)的顯微操作儀，在受精卵分裂之前進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入，每個(gè)細(xì)胞注射轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒（pzu6p-siMSTN）1 nL，供體質(zhì)粒的注射劑量為40 pg，對(duì)照鯉注射生理鹽水。注射后的受精卵放在23～24℃水簇箱中孵化。

1.5 轉(zhuǎn)基因鯉總DNA 提取

裂解液為蛋白酶K（200 μg/mL），十二烷基肌氨酸鈉（0.5%），乙二胺四乙酸二鈉（200 mmol/L，pH8.0）。幼魚整體勻漿，加入100 μL 裂解液，55℃消化，用酚、氯仿、異戊醇混合液，抽提3 次，無水乙醇沉淀，自然干燥后溶解于TE 中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 外源基因整合率的檢測

根據(jù)鯉MSTN 干涉載體序列設(shè)計(jì)引物。上游引物：CTGCGATTAATTCTTTAGCCTCCGAGAG；下游引物：GCAAAGGCGGTGCGGGAT。

引物由上海生物工程有限公司合成。以鯉轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒pzu6p-siMSTN 為陽性對(duì)照，以對(duì)照鯉為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR 分析。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，93℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，38 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR 反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)程序在PE9700 上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，goldview 染色，GDS8000（UVP 公司）凝膠成像系統(tǒng)拍攝，回收轉(zhuǎn)基因陽性鯉中的目標(biāo)條帶，進(jìn)行測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒的構(gòu)建

通過將真核表達(dá)載體PEGFP-C1 的啟動(dòng)子進(jìn)行改造，得到斑馬魚U6 啟動(dòng)子的質(zhì)粒pzu6p-siRNA。然后將干涉片段siMSTN 與載體相連接，得到pzu6p-siMSTN（鯉MSTN 干涉載體）。

2.2 鯉mstn 外源基因的轉(zhuǎn)基因效果

共進(jìn)行了5 批鯉受精卵的轉(zhuǎn)基因注射，共注射受精卵1 225 粒，孵出后存活720 尾，轉(zhuǎn)基因顯微注射平均存活率為58.6%，注射生理鹽水的對(duì)照組的存活率為92%（表1）。

2.3 PCR 檢測

對(duì)50 尾轉(zhuǎn)基因魚個(gè)體的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小在400 bp 左右（圖2）。將與供體片段一致的基因片段切下，對(duì)其中5 尾樣品的陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和測序驗(yàn)證，測序結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，鯉外源基因成功插入鯉基因組中，轉(zhuǎn)基因鯉外源基因的平均整合率為36.2%（表1）。

圖2 轉(zhuǎn)鯉mstn 基因鯉的PCR 檢測分析Fig.2 The detection results of PCR for transgenic carp

圖3 轉(zhuǎn)mstn 基因鯉片段序列與供體質(zhì)?；蛐蛄斜葘?duì)Fig.3 Sequence alignment of mstn gene between transgenic common carp and donor plasmid of mstn gene

表1 轉(zhuǎn)mstn 基因鯉幼魚存活率和陽性率檢測Tab.1 Survival and transgenic positive rates in common carp juveniles via microinjection with mstn gene

3 討論

不同物種之間存在種屬差異，要想啟動(dòng)不同基因的表達(dá)需要種屬較為特異的啟動(dòng)子啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[24]，干涉片段的表達(dá)用U6 啟動(dòng)子或者H1 啟動(dòng)子能有效表達(dá)干涉片段，為了實(shí)現(xiàn)mstn 基因在鯉體內(nèi)沉默，使用鯉U6 啟動(dòng)子最為理想。但鯉的U6 啟動(dòng)子序列未知，所以本文選用了種屬差異較近的斑馬魚U6 啟動(dòng)子，它具有明確的起始和終止序列，在細(xì)胞中可以表達(dá)很多小分子RNA。siRNA 表達(dá)載體依賴U6 啟動(dòng)子，可控制一段45～50 nt 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（small hairpin RNA，shRNA）在鯉細(xì)胞中的表達(dá)，而shRNA 在鯉細(xì)胞內(nèi)可以自動(dòng)被加工成為siRNA，引發(fā)目標(biāo)基因的沉默或其表達(dá)受到抑制。如劉萱等[25]利用人H1 啟動(dòng)子構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA（small interference RNA，小干擾RNA）表達(dá)質(zhì)粒pBS/HIPS。該質(zhì)粒約有19 bp 的siRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，能夠在細(xì)胞內(nèi)自主合成，對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性目標(biāo)RNA 起到了特異性抑制作用。Sui 等[26]利用U6 啟動(dòng)子構(gòu)建了可操縱的siRNA表達(dá)載體，該載體質(zhì)粒成功抑制了多種外源和內(nèi)源基因的表達(dá)。說明利用U6 啟動(dòng)子引導(dǎo)產(chǎn)生siRNA的質(zhì)粒載體，可在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA，抑制mstn 基因的表達(dá)，可達(dá)到較高的RNAi 效應(yīng)。本研究主要是針對(duì)鯉myostatin 基因序列，構(gòu)建以斑馬魚U6 為啟動(dòng)子的鯉myostatin 基因的RNA 干擾質(zhì)粒載體pzu6p-siMSTN（鯉MSTN 干涉載體）。通過酶切和測序驗(yàn)證載體構(gòu)建正確性。為了能確定鯉myostatin 雙鏈RNA 是否能夠插入鯉基因組中，用人工合成的鯉MSTN 干涉載體通過顯微注射技術(shù)將pzu6p-siMSTN 基因?qū)胍磅幨芫褍?nèi)，獲得了一批轉(zhuǎn)基因鯉，PCR 檢測和測序驗(yàn)證表明，外源供體基因成功插入鯉基因組中，轉(zhuǎn)基因鯉外源基因的整合率平均為36.2%。

隨著鯉基因組測序的完成，生物學(xué)研究從單個(gè)基因進(jìn)入到基因組時(shí)代，利用siRNA 介導(dǎo)的RNA干擾手段，或者結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將有望成為探索魚類特定基因的功能、疾病致病機(jī)理及其防治的新途徑。Acosta 等[27]利用顯微注射技術(shù)，將具有siRNA的mstn 基因質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚體內(nèi)，使其MSTN 蛋白的表達(dá)受抑制，最終獲得了體形巨大的斑馬魚。Thomas 等[28]體外合成的具有發(fā)卡RNA 表達(dá)載體質(zhì)粒，利用顯微注射技術(shù)導(dǎo)入到大鼠內(nèi)，使大鼠的纖維大小增加34%，肌肉重量增加10%。在魚類育種中，雖然分子輔助育種技術(shù)和基因敲除技術(shù)（反義核苷酸技術(shù)、基因打靶技術(shù)等）較傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳育種有較多的優(yōu)點(diǎn)，但研究過程中投入大，群體大，耗時(shí)、效率低等缺點(diǎn)也有待解決。RNA 干擾技術(shù)已成為解決這些問題的重要手段。與其他方法相比，RNA 干擾技術(shù)在基因功能研究具有簡單易行、試驗(yàn)周期短、成本低、可進(jìn)行高通量基因功能分析及具有高度特異性等許多優(yōu)點(diǎn)。為了解除mstn 基因?qū)∪饧?xì)胞的抑制作用，本研究利用RNA 干擾技術(shù)干擾mstn mRNA 的表達(dá)，來提高養(yǎng)殖魚類肌肉含量，改善肉質(zhì)性狀，促進(jìn)養(yǎng)殖魚類生長。

綜上所述，RNA 干擾技術(shù)能達(dá)到基因敲除的結(jié)果，是研究這些基因功能的良好工具。RNA 干擾技術(shù)在充滿挑戰(zhàn)的后基因時(shí)代將有廣闊的應(yīng)用前景，它將會(huì)在水產(chǎn)動(dòng)物，尤其是在魚類研究中帶來一次新的技術(shù)革命。研究結(jié)果表明，這種阻礙肌肉生長抑制素的方法將有助于鯉肌肉再生能力的增強(qiáng),為獲得具有特殊功能的轉(zhuǎn)基因鯉提供了新的手段，也進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)鯉mstn 基因RNA 干擾質(zhì)粒技術(shù)是可行的育種技術(shù)之一[29]。