竺芊惠 胡霞 張宇鋆 王天康 邱琳凌

摘要：根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種重要的革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌，幾乎能侵染所有的雙子葉植物引起根瘤。近年來(lái)，科學(xué)家們廣泛篩選拮抗微生物來(lái)進(jìn)行櫻花根癌病的防治。本項(xiàng)目從櫻花種植苗圃的發(fā)病植株根際微生物中，分離出了4株對(duì)根癌農(nóng)桿菌At2有著抑菌效果的菌株，其中一株效果最為明顯，將其命名為L(zhǎng)W3。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)初步鑒定其屬于假單胞桿菌（Pseudomonas）。利用細(xì)菌16S rRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該菌與摩氏假單胞菌（P. mosselii CIP 105259T）高度同源。該菌的成功分離，為生產(chǎn)櫻花根癌病拮抗菌提供了新的菌源，也為早期進(jìn)行櫻花根癌病的預(yù)防提供了可能。

關(guān)鍵詞：根癌農(nóng)桿菌;摩氏假單胞菌;拮抗菌;生物防治

1.引言

櫻歸屬于李屬（Prunus）下的櫻桃亞屬（Cerasus），其原產(chǎn)地主要分布在亞洲的中國(guó)、日本、韓國(guó)等地[1]。但在櫻花繁育基地，一種土傳病害-根癌病，正嚴(yán)重影響著櫻花的生長(zhǎng)，制約櫻花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。相關(guān)文獻(xiàn)表明，浙江省寧波市櫻花主要栽培區(qū)平均發(fā)病率達(dá)30%，重發(fā)區(qū)塊植株患病率甚至高達(dá)92%[2]。綜上，櫻花根癌病的早期預(yù)防是防治該病的關(guān)鍵手段。

生物防治中的拮抗菌預(yù)防，因其天然、無(wú)污染、效果好的優(yōu)點(diǎn)，成為科研人員的研究對(duì)象。在根癌病的防治中，目前應(yīng)用最廣的是澳大利亞科學(xué)家Kerr分離的一種放射土壤桿菌K84，該菌能夠產(chǎn)生核苷酸類細(xì)菌素，對(duì)根癌病的防治非常有效。當(dāng)菌液濃度為106個(gè)/ml時(shí)，即可有效控制根癌病的發(fā)生[3]。K84的改造菌株K1026、WJK84-1能夠成功的用于桃樹(shù)等核果類果樹(shù)根癌病的防治。

基于以上現(xiàn)狀，本研究分別采集櫻花種植苗圃土壤，從中篩選對(duì)致病根癌農(nóng)桿菌具有拮抗作用的生防菌，得到一株具有較強(qiáng)抑菌活性的細(xì)菌LW3。通過(guò)生理生化以及分子生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行鑒定，判斷其為摩氏假單胞菌，同時(shí)也對(duì)該菌進(jìn)行了離體的拮抗作用分析，為根癌病防治的微生物菌肥生產(chǎn)提供資源。

2.材料與方法

2.1 土壤拮抗菌的分離及篩選

選取櫻花根系附近的土壤，通過(guò)梯度稀釋的方法進(jìn)行稀釋，獲得單克隆。通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行拮抗作用分析，觀察抑菌圈的產(chǎn)生并測(cè)量抑菌圈的直徑。

2.2拮抗菌的鑒定

拮抗菌的鑒定分別從形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)三個(gè)方面進(jìn)行分析。形態(tài)學(xué)：利用透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。生理生化指標(biāo)鑒定項(xiàng)目參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。分子生物學(xué)鑒定利用細(xì)菌通用16S rRNA引物F8 / R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3.結(jié)果與分析

3.1 拮抗菌的分離

通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)測(cè)定，從根際細(xì)菌中篩選獲得了一株拮抗菌，將其命名為L(zhǎng)W3。該菌株對(duì)At2的抑菌圈直徑在共培養(yǎng)4d后，抑菌圈的直徑達(dá)到了51mm（圖1a）。

3.2 拮抗菌的鑒定

菌株LW3在YEB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形、光滑，顏色灰白色。革蘭氏染色陰性，透射電鏡觀察顯示，該菌具有極生鞭毛（圖1b）。生理生化特征檢測(cè)分析，該菌不能在4℃和42℃生長(zhǎng)，氧化酶、水解酶陽(yáng)性、好氧生長(zhǎng)、硝酸鹽還原陰性、檸檬酸鹽利用陽(yáng)性、可利用甘露醇、麥芽糖、木糖等碳源、不能水解DNA。根據(jù)該菌菌落特征以及生理生化指標(biāo)，初步判斷LW3為假單胞桿菌（Pseudomonas）。16S rRNA序列分析結(jié)果表明，菌株LW3與P. mosselii親緣關(guān)系最近，因此，將該菌歸為摩氏假單胞桿菌。

4. 討論

目前，已有報(bào)道證明，摩氏假單胞桿菌對(duì)多種病原菌具有拮抗作用，拮抗范圍涵蓋人類、昆蟲(chóng)以及植物相關(guān)的病原菌。在這些研究中，僅有兩例關(guān)于該菌對(duì)植物病原物的拮抗，一個(gè)是P. mosselii BS011菌株中的c-xtl基因簇被證明正調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性，另外一個(gè)是通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)Ralstonia solanacearum ripAA基因，使P. mosselii產(chǎn)生了對(duì)煙草細(xì)菌性萎蔫病的抗性[4，5]。本研究從櫻花土壤致病菌根癌農(nóng)桿菌入手，篩選出來(lái)一株摩氏假單胞菌LW3，并證明該菌對(duì)致病根癌農(nóng)桿菌的強(qiáng)烈抑菌作用，是之前尚未報(bào)道的。通過(guò)離體和活體實(shí)驗(yàn)證明，LW3通過(guò)抑制根癌農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，從而降低其致病性來(lái)起作用。但是，該菌具體通過(guò)分泌哪種抑菌、抗菌物質(zhì)來(lái)達(dá)到此效果，還需要進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

參考文獻(xiàn)：

[1] Li C L，Bruce B. Flora of China. Beijing：Science Press， 2003， 9： 404-420

[2] 王志龍，金楊唐，譚志文，王國(guó)良，林立. 寧波櫻花根癌病病原細(xì)菌鑒定，植物保護(hù)， 2014，40（3）：147-150

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