張偉博，王米其，王鵬杰,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學 營養(yǎng)與健康系，北京 100083)

在中式菜肴的烹飪過程中，人們通過將花椒加入到食用油中，以其產(chǎn)生的獨特風味來掩蓋菜肴中的腥膻等異味[1]。在食品加工領域，食品企業(yè)在開發(fā)不同產(chǎn)品時，常會添加炸花椒油來賦予食品濃烈的香味和麻味，如火鍋底料、麻辣牛肉干、麻婆豆腐、自熱麻辣小火鍋等。因此，炸花椒油在食品領域中具有廣泛的應用。炸花椒油的風味主要為香氣和麻味[2-3]，是評價炸花椒油品質(zhì)的重要指標之一。然而炸花椒油的制備過程主要是依據(jù)傳統(tǒng)的經(jīng)驗操作，且在實驗室的前期工作中發(fā)現(xiàn)仍有較高含量的風味物質(zhì)殘留在花椒殘渣中。因此，優(yōu)化炸花椒油中風味物質(zhì)的提取工藝，有利于提高炸花椒油中風味物質(zhì)的濃度，對其工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的實踐意義。

據(jù)文獻報道，炸花椒油中的關鍵香氣物質(zhì)主要是芳樟醇、D-檸檬烯等萜烯類化合物[4]，而萜類化合物在植物體內(nèi)主要是通過異戊二烯代謝途徑產(chǎn)生[5-6]。麻味成分來源于酰胺類物質(zhì)，包括羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素等，這些風味物質(zhì)是存在于自然界中的天然產(chǎn)物[7-8]。因此，炸花椒油中風味物質(zhì)主要來源于花椒，非炸制過程中通過化學反應產(chǎn)生。而酶處理可以促進風味物質(zhì)的溶出[9]。因此，本文首先對比了果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶和Viscozyme L(包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶和木聚糖酶)對炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)含量的影響，并篩選出了最優(yōu)的酶，然后對其添加量、酶解溫度、酶解時間進行優(yōu)化，在此基礎上進行了響應面試驗，確定最優(yōu)酶解工藝，以期為炸花椒油的工業(yè)化生產(chǎn)奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛油：溢洋油脂有限公司；花椒：北京美廉美超市；癸酸乙酯、果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶：美國Sigma-Aldrich試劑公司；Viscozyme L：諾維信(中國)生物技術有限公司；羥基-α-山椒素：上海源葉生物科技有限公司；羥基-β-山椒素：上海甄準生物科技有限公司；乙腈(HPLC)、甲醇(HPLC)：北京百靈威科技有限公司；醋酸：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、色譜柱 美國安捷倫公司；嗅辨儀 德國Gerstel公司；高效液相色譜儀 日本島津有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 麻味物質(zhì)的定性定量分析

對麻味物質(zhì)進行提取。準確稱取1 g(精確至0.001 g)樣品于玻璃瓶中，用20 mL甲醇進行萃取，搖勻，水浴超聲0.5 h，將上清液轉移至玻璃瓶中，再次加入15 mL甲醇至玻璃瓶中進行二次萃取，搖勻，水浴超聲0.5 h，冷卻至室溫，合并兩次得到的甲醇溶液，離心(2000 g×15 min)去除沉淀，吸取上清液至50 mL容量瓶中，補充甲醇的體積至刻度線。

參照朱建朝等[10]的方法并略做修改，對麻味物質(zhì)的種類和含量進行分析。采用高效液相色譜法對上述得到的溶液進行分析，色譜條件：色譜柱：Agela-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶水為2∶3(體積比)；流速：1.2 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：270 nm。

標準曲線的建立：用甲醇稀釋羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素并配制成濃度分別為10.00，20.00，50.00，100.00，300.00 μg/mL和19.53，39.06，78.13，156.25，312.50 μg/mL。

1.3.2 香氣物質(zhì)的定性定量分析

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法：色譜條件：色譜柱DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)，膜厚度0.20 mm，載氣為高純He，流速為1.6 mL/min。升溫程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫到230 ℃，保持2 min，共運行43 min。進樣口溫度250 ℃，采用分流進樣模式，分流比為20∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源，能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；質(zhì)量掃描范圍為40～700 m/z；掃描方式為全掃描，溶劑延遲3 min。

香氣物質(zhì)的定量分析：采用內(nèi)標法(癸酸乙酯)對揮發(fā)性化合物進行內(nèi)標半定量分析。揮發(fā)性化合物的計算見公式(1)：

公式(1)

注：C(x)為待測揮發(fā)性組分x的濃度；C(i)為內(nèi)標物i在待測樣品中的濃度；A(x)為待測揮發(fā)性組分x的峰面積；A(i)為內(nèi)標物i的峰面積。

1.3.3 酶的種類對關鍵風味物質(zhì)含量的影響

采用果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶和Viscozyme L分別對花椒進行處理。將1%(酶/花椒，W/W)的酶溶解于30 g水中，然后將酶溶液與100 g花椒混勻，酶解時間為2 h，酶解溫度為50 ℃。酶解后，對花椒進行炸制，炸制工藝為：稱取380 g牛油于容器中，加熱至100 ℃，關火，加入酶解后的花椒，開火炸至110 ℃，加入20 g清水再次炸至110 ℃，關火，加入120 g牛油。最后去除花椒殘渣，得到炸花椒油。測定炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)的含量，以篩選出最優(yōu)的酶。對篩選出最優(yōu)的酶進行酶解溫度、酶添加量和酶解時間的優(yōu)化。

1.3.4 酶解溫度對關鍵風味物質(zhì)含量的影響

考察酶解溫度對炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)含量的影響：保持相同的酶添加量和酶解時間，酶解溫度分別為40，45，50，55，60 ℃，對花椒進行酶處理。酶解完成后，對其進行炸制，測定對應炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)的含量。

1.3.5 酶添加量對關鍵風味物質(zhì)含量的影響

考察酶添加量對炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)含量的影響：保持酶解溫度和酶解時間一致，酶的添加量分別為0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，對花椒進行酶處理。酶解完成后，對其進行炸制，測定對應炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)的含量。

1.3.6 酶解時間對關鍵風味物質(zhì)含量的影響

考察酶解時間對炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)含量的影響：保持酶解溫度和酶添加量一致，酶解時間分別為0.5，1，2，4，6，8，10 h，對花椒進行酶處理。酶解完成后對其進行炸制，測定對應炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)的含量。

1.3.7 酶解參數(shù)的響應面試驗

通過單因素試驗確定了最佳的酶解溫度、酶添加量和酶解時間。但是各個因素之間可能會存在相互影響，為了確定3個因素之間的最佳比例，在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，通過三因素三水平響應面分析法，以關鍵風味物質(zhì)濃度的加權平均值為指標，進行響應面優(yōu)化試驗，得到最優(yōu)酶解工藝。

1.3.8 原工藝制備炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)含量的測定

稱取100 g花椒，混勻，加入30 g水，混勻；稱取380 g牛油于容器中，加熱至100 ℃，關火，加入酶解后的花椒，開火炸至110 ℃，加入20 g清水再次炸至110 ℃，關火，加入120 g牛油。最后去除花椒殘渣，得到炸花椒油，測定炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)的含量。

2 結果與討論

2.1 酶的種類對關鍵風味物質(zhì)含量的影響

分析酶的種類對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)含量的影響，結果見圖1。

圖1 酶的種類對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of different enzymes on the content of key aroma substances in the fried Zanthoxylum oil

由圖1可知，炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)含量的高低順序為Viscozyme L>果膠酶>纖維素酶>木瓜蛋白酶，其中由Viscozyme L處理花椒后制備的炸花椒油中芳樟醇、乙酸芳樟酯、4-萜烯醇的含量均高于果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶處理花椒后制備的炸花椒油中對應物質(zhì)的含量，且關鍵香氣物質(zhì)的含量之和也出現(xiàn)了相同的結果。Viscozyme L可以通過降解β-葡聚糖，從而將以糖苷結合態(tài)存在的香氣物質(zhì)釋放出來，使得炸花椒油中香氣物質(zhì)的含量升高[11]。

分析酶的種類對炸花椒油中麻味物質(zhì)含量的影響，結果見圖2。

圖2 酶的種類對炸花椒油中麻味物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of different enzymes on the content of numb-taste substances in the fried Zanthoxylum oil

由圖2可知，炸花椒油中麻味物質(zhì)含量高低的順序為Viscozyme L>果膠酶>纖維素酶>木瓜蛋白酶。采用Viscozyme L處理得到炸花椒油中羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素的含量最高，麻味物質(zhì)含量之和也出現(xiàn)了相同的結果。綜合考慮酶的種類對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)和麻味物質(zhì)含量的影響，可以認為Viscozyme L是提高炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)含量最有效的酶。接下來對Viscozyme L的酶解溫度、酶解時間和酶添加量進行優(yōu)化。

2.2 酶解溫度對關鍵風味物質(zhì)含量的影響

分析酶解溫度對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)含量的影響，結果見圖3。

圖3 酶解溫度對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of enzyme hydrolysis temperature on the content of key aroma substances in the fried Zanthoxylum oil

由圖3可知，當酶解溫度為40～50 ℃時，關鍵香氣物質(zhì)如芳樟醇和4-萜烯醇的濃度隨著酶解溫度的升高而逐漸增加。當酶解溫度超過50 ℃后，其含量呈下降趨勢。此外，當酶解溫度為50 ℃時，關鍵香氣物質(zhì)的濃度之和出現(xiàn)最大值。這主要是因為當溫度升高至最佳溫度以上會導致部分酶的活性喪失，阻礙了酶解進程，導致關鍵香氣物質(zhì)的濃度出現(xiàn)下降趨勢。乙酸芳樟酯的濃度在酶解溫度為55 ℃時才出現(xiàn)拐點，可能是因為部分芳樟醇反應生成了乙酸芳樟酯，導致拐點的延后。

分析酶解溫度對炸花椒油中麻味物質(zhì)含量的影響，結果見圖4。

由圖4可知，當酶解溫度小于50 ℃時，隨著酶解溫度的升高，羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素的含量呈現(xiàn)增長趨勢。當酶解溫度超過50 ℃后，羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素出現(xiàn)下降趨勢。綜合考慮酶解溫度對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)和麻味物質(zhì)含量的影響，可選用50 ℃作為響應面優(yōu)化中酶解溫度參數(shù)的中心點。

圖4 酶解溫度對炸花椒油中麻味物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of enzyme hydrolysis temperature on the content of numb-taste substances in the fried Zanthoxylum oil

2.3 酶添加量對關鍵風味物質(zhì)含量的影響

分析酶添加量對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)的影響，結果見圖5。

由圖5可知，酶解花椒后制備的炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)的含量均高于未經(jīng)過酶處理的炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)的含量，表明酶處理可以增加炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)的含量。可能是由于Viscozyme L破壞糖苷鍵，從而導致以糖苷鍵結合態(tài)的萜烯類化合物被釋放出來，致使關鍵香氣物質(zhì)的含量升高。當酶添加量為3%時，炸花椒油中芳樟醇、乙酸芳樟酯、4-萜烯醇的含量最高。當繼續(xù)增加酶添加量時，關鍵香氣物質(zhì)沒有觀察到相應的增加。關鍵香氣物質(zhì)含量之和也呈現(xiàn)相同的趨勢。

圖5 酶添加量對關鍵香氣物質(zhì)含量的影響Fig.5 Effect of enzyme additive amount on the content of key aroma substances in the fried Zanthoxylum oil

分析酶添加量對炸花椒油中麻味物質(zhì)含量的影響，結果見圖6。

由圖6可知，酶添加量為0%～3%時，隨著酶添加量的增加，麻味物質(zhì)的含量呈現(xiàn)增加趨勢，當繼續(xù)增加酶添加量至4%時，未觀察到相應的增加。綜合考慮酶的添加量對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)和麻味物質(zhì)含量的影響，選用3%作為響應面優(yōu)化中酶添加量參數(shù)的中心點。

圖6 酶添加量對麻味物質(zhì)含量的影響Fig.6 Effect of enzyme additive amount on the content of numb-taste substances in the fried Zanthoxylum oil

2.4 酶解時間對關鍵風味物質(zhì)含量的影響

分析酶解時間對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)含量的影響，結果見圖7。

圖7 酶解時間對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)含量的影響Fig.7 Effect of enzyme hydrolysis time on the content of key aroma substances in the fried Zanthoxylum oil

由圖7可知，當酶解時間小于4 h時，隨著酶解時間的延長，乙酸芳樟酯和4-萜烯醇的含量呈現(xiàn)增加趨勢，當繼續(xù)延長酶解時間，其含量呈下降趨勢。關鍵香氣物質(zhì)濃度之和也呈現(xiàn)相同的趨勢，可能是因為在長時間的酶解過程中關鍵香氣物質(zhì)揮發(fā)至空氣中導致濃度下降。隨著酶解時間的延長，芳樟醇的含量呈現(xiàn)出不同于乙酸芳樟酯和4-萜烯醇的趨勢，酶解時間為8 h較6 h制備的炸花椒油中芳樟醇的含量出現(xiàn)了大幅度的下降，可能是因為芳樟醇具有更強的揮發(fā)性。

分析酶解時間對炸花椒油中麻味物質(zhì)的影響，見圖8。

圖8 酶解時間對炸花椒油中麻味物質(zhì)含量的影響Fig.8 Effect of enzyme hydrolysis time on the content of numb-taste substances in the fried Zanthoxylum oil

由圖8可知，酶解時間為0.5～4 h時，隨著酶解時間的延長，羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素的濃度呈現(xiàn)增長趨勢。當酶解時間大于4 h時，炸花椒油中麻味物質(zhì)出現(xiàn)了輕微下降趨勢，之后穩(wěn)定在同一水平。這主要是因為酶是生物催化劑，需要適當?shù)姆磻獣r間才能分解細胞壁，當反應完成后，就不會再進行明顯的細胞壁降解。綜合考慮酶解時間對炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)和麻味物質(zhì)含量的影響，可選用4 h作為響應面優(yōu)化中酶添加量參數(shù)的中心點。

2.5 響應面優(yōu)化

按照表1設計響應面試驗因素與水平，采用Box-Behnken Design建立數(shù)學模型。以關鍵風味物質(zhì)濃度的加權平均值為指標(R)，以關鍵香氣物質(zhì)濃度之和的最大值以及麻味物質(zhì)濃度之和的最大值為參照，關鍵風味物質(zhì)濃度的加權平均值=(N1/654.67)×50+(N2/9.61)×50，試驗結果見表1。利用Design-Expert 8.6對試驗結果進行回歸分析，得到回歸方程為R=95.50+3.16A-0.98B-1.04C-1.57AB-5.52AC-3.81BC-5.54A2-0.78B2-5.93C2。

表1 Box-Behnken設計及結果Table 1 Box-Behnken design and results

方差分析及顯著性分析結果見表2。

表2 回歸分析結果Table 2 The results of regression analysis

由表2可知，模型的P<0.0001，說明建立的回歸方程極顯著；失擬項的P=0.0883>0.05，差異不顯著，說明模型對試驗的擬合程度良好，可以預測試驗結果。模型的決定系數(shù)R2=0.9776，RAdj2=0.9488，說明回歸方程可較好地解釋各因素和響應值之間的真實關系。由P值可知，A和C為顯著影響因素，B為不顯著因素。交互作用AC、BC為顯著影響因素，AB的交互作用不顯著。3個因素對炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)的影響順序為：酶解溫度>酶解時間>酶添加量。

酶解溫度和酶添加量、酶解溫度和酶解時間、酶添加量和酶解時間交互影響炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)濃度的加權平均值的響應面圖和等高線見圖9。

圖9 酶解溫度、酶添加量和酶解時間對炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)濃度的加權平均值的交互影響Fig.9 Interactive effects of enzymatic hydrolysis temperature, enzyme additive amount and enzymatic hydrolysis time on the weighted average values of key flavor substances＇ concentration in fried Zanthoxylum oil

由圖9可知，AC和BC之間的交互作用顯著，但是AB之間的交互作用不顯著。由圖9還可知各因素與響應值之間的關系，其中對響應值影響最為顯著的為A，表現(xiàn)為曲線較陡，其次是C因素，B因素表現(xiàn)為坡度較緩，這與方差分析中的F值結果一致。當關鍵風味物質(zhì)含量和為最大值時，酶解時間為4.94 h，酶添加量為2.50%，酶解溫度為52.50 ℃，在此條件下，預測炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)濃度的加權平均值為77.87。

為了驗證響應面分析的可靠性，并考慮到實際操作的便利性，將最佳提取工藝略作調(diào)整，調(diào)整后的工藝為：酶解時間為5.00 h，酶添加量為2.50%，酶解溫度為52.50 ℃。測定其關鍵風味物質(zhì)的含量，并計算其濃度的加權平均值，實際測定值為76.88，與模型值相差1.27%，表明預測條件是可靠的。

2.6 原工藝和最優(yōu)酶解工藝制備的炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)含量的比較

比較由原工藝和最優(yōu)工藝制備的炸花椒油中風味物質(zhì)的含量，見表3。

表3 原工藝和最優(yōu)酶解工藝制備的炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)含量的比較Table 3 Comparison of the content of key flavor substances in the fried Zanthoxylum oil prepared by the original process and the optimal enzymatic hydrolysis process

由表3可知，最優(yōu)酶解工藝制備的炸花椒油中芳樟醇、乙酸芳樟酯、4-萜烯醇的濃度相比原工藝分別提高了35.02%、120.17%、146.06%，關鍵香氣物質(zhì)濃度之和提高了77.99%；羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素分別提高了107.34%和118.52%，麻味物質(zhì)濃度之和提高了114.43%，表明酶解花椒有效提高了炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)的含量。

3 結論

本文分析了酶解條件對炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)濃度的影響，并以關鍵風味物質(zhì)濃度的加權平均值為指標對炸花椒油中酶解工藝進行響應面分析。炸花椒油中最優(yōu)酶解條件為Viscozyme L酶添加量2.50%、酶解時間5.00 h、酶解溫度52.50 ℃，在此條件下，炸花椒油中風味物質(zhì)濃度的加權平均值為76.88，與模型值相差1.27%，表明預測條件是可靠的。由最優(yōu)酶解工藝制備的炸花椒油中關鍵香氣物質(zhì)濃度之和相比原工藝提高了77.99%，麻味物質(zhì)濃度之和提高了114.43%，表明酶解花椒有效提高了炸花椒油中關鍵風味物質(zhì)的含量，這將為提升炸花椒油的品質(zhì)奠定理論基礎。