楊敏娟，楊小龍，黃銀平，孫冬梅，魏 梅

(廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244)

延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，功能與主治為活血、行氣、止痛[1]。延胡索適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)周期短，分布廣泛。主產(chǎn)于浙江東陽(yáng)和磐安、陜西漢中、安徽蕪湖、江蘇南通、重慶等地[2]。延胡索的化學(xué)成分主要有異喹啉型生物堿，以及有機(jī)酸、淀粉、皂醇類、粘液質(zhì)、樹(shù)脂、皂苷類和無(wú)機(jī)元素。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從延胡索中分離鑒定出40多個(gè)化合物，分別為原阿片堿類、原小檗堿類、異喹啉苯并菲啶類、阿樸菲類、異喹啉芐咪唑類、雙芐基異哇琳類等，其中，原小檗堿類最多[3]。

指紋圖譜在現(xiàn)代分析技術(shù)的基礎(chǔ)上，可以標(biāo)示中藥材特征性的圖譜[5]。它具有整體性，能夠全面體現(xiàn)中藥材的化學(xué)成分，已成為中藥材控制質(zhì)量、鑒別真?zhèn)蔚闹匾椒╗4]。主成分分析法是應(yīng)用現(xiàn)代分析軟件SPSS的統(tǒng)計(jì)方法[5]，依據(jù)貢獻(xiàn)率大小篩選具有代表性的成分因子。近年來(lái)主成分分析法結(jié)合指紋圖譜[6-9]，成為一種獨(dú)具特色的多指標(biāo)評(píng)價(jià)技術(shù)。本研究在對(duì)延胡索產(chǎn)地進(jìn)行實(shí)地調(diào)研的基礎(chǔ)上，共收集了30批延胡索藥材，分別產(chǎn)自陜西、浙江、安徽以及江蘇。采用高效液相色譜法建立延胡索藥材指紋圖譜，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)和主成分分析法，探討延胡索藥材產(chǎn)地的形成原因，為延胡索今后的開(kāi)發(fā)利用、科學(xué)評(píng)價(jià)以及質(zhì)量控制提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

延胡索購(gòu)自各產(chǎn)地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定為CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。原阿片堿(含量：99.7%，批號(hào)：110853-201404)、鹽酸巴馬汀(含量：87.4%，批號(hào)：110732-201510)、鹽酸小檗堿(含量86.8%，批號(hào)：110713-201613)、延胡索乙素(含量：99.8%，批號(hào)：110726-201516)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；鹽酸藥根堿(批號(hào)：wkq-00629，含量均>98%)、去氫紫堇堿(批號(hào)：wkq16090204，含量均>98%)、紫堇堿(批號(hào)：wkq17060802，含量均>98%)均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；色譜級(jí)磷酸、三乙胺、乙腈、甲醇(德國(guó)默克股份有限公司)；水為超純水，其他為分析純；高效液相色譜儀(沃特斯公司)，Agilent 1260分析型高效液相色譜儀(安捷倫公司)；Agilent 6210 LC/MSD TOF質(zhì)譜儀(安捷倫公司)，ME204E分析天平(梅特勒-托利多公司)，數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

表1 不同產(chǎn)地延胡索藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 指紋圖譜色譜條件 色譜柱為phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流速為0.8 mL/min；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸為流動(dòng)相B，按0～15 min，10%→17%A；15～65 min，17%→30%A；65～85 min，30%→55%A；85～105 min，55%→80%A；105～115 min，80%→85%A；115～116 min，85%→10%A；116～130 min，10%A進(jìn)行梯度洗脫。

2.1.2 指認(rèn)色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，0.01%氯化銨溶液為流動(dòng)相B，按0～10 min，10%→17%A；10～25 min，25%A；25～35 min，25%→26%A；35～60 min，26%→95%A進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為ESI (正離子模式)；干燥器溫度為325 ℃；干燥氣流速為10 L/min；毛細(xì)管電壓為4.0 kV；掃描質(zhì)核比范圍為100～1 500；自動(dòng)參比離子為121.050 9和922.009 8。

2.3 溶液的制備

2.3.1 參照物溶液的制備 精密稱取原阿片堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別約為100μg/mL的混合溶液，過(guò)0.22μm微孔濾膜，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別檢測(cè)，結(jié)果顯示，各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%，該方法重復(fù)性良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0，2，4，8，12，16，20，24 h進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示，各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3.0%，該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分析連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3.0%，該方法精密度良好。

2.5 色譜峰的指認(rèn)

取上述供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)色譜峰的保留時(shí)間、光譜數(shù)據(jù)以及與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，延胡索藥材指紋圖譜中7個(gè)色譜峰得到了明確的指認(rèn)。根據(jù)保留時(shí)間先后，它們分別為原阿片堿、鹽酸藥根堿、延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿和紫堇堿，如圖1所示，各色譜峰的峰號(hào)、保留時(shí)間、名稱、CAS號(hào)、分子式和結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表2。

表2 延胡索藥材指紋圖譜色譜峰的指認(rèn)

圖1 延胡索藥材指紋圖譜色譜峰指認(rèn)色譜

2.6 延胡索藥材指紋圖譜的建立

取30批延胡索藥材，按“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表3；將結(jié)果導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”，以S1樣品為參照譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.10s，計(jì)算各產(chǎn)地延胡索與對(duì)照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和表4。結(jié)果表明，30批延胡索藥材中有16個(gè)共有峰，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于2.0%，相對(duì)峰面積RSD值范圍為28.0%～117.2%；30批延胡索藥材相似度范圍為0.835～0.999，四個(gè)產(chǎn)地的延胡索質(zhì)量有一定差異。

圖3 不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜疊加

表3 延胡索藥材指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積結(jié)果

表4 不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.7 主成分分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜的共有峰峰面積進(jìn)行主成分分析，計(jì)算初始因子載荷矩陣及累積貢獻(xiàn)率。

不同產(chǎn)地延胡索藥材指紋圖譜的主成分分析結(jié)果見(jiàn)表5，初始因子載荷矩陣見(jiàn)表6。以特征值>1為界限，提取到4個(gè)主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為84.72%。由表7可知，第1主成分的特征根為7.448，累計(jì)貢獻(xiàn)率為46.55%，成分4、5、7、8、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿及16在第1主成分上有較高載荷，說(shuō)明第1主成分主要反映了以上8個(gè)成分的信息；第2主成分特征根為2.663，累計(jì)貢獻(xiàn)率為16.64%，主要反映了2、原阿片堿、鹽酸藥根堿、7、12及15成分的信息。以主成分為變量得到載荷圖和得分圖，見(jiàn)圖5。由載荷圖可知，距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的是主成分1和2中權(quán)重值大的成分，其在決定產(chǎn)地差異上具有重大作用。由得分圖可知，整體上各產(chǎn)地延胡索藥材分布比較集中，S22樣品比較離群。

注：峰3：原阿片堿；峰6：鹽酸藥根堿；峰9：鹽酸巴馬??；峰10：鹽酸小檗堿；峰11：去氫紫堇堿；峰13：延胡索乙素；峰14：紫堇堿。

表5 主成分分析結(jié)果

表6 初始因子載荷矩陣

圖4 不同產(chǎn)地延胡索的載荷圖(上)和得分圖(下)

2.8 不同產(chǎn)地延胡索藥材的綜合評(píng)價(jià)

用4個(gè)主成分對(duì)不同產(chǎn)地的延胡索藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，計(jì)算綜合得分，結(jié)果如表7所示。由表7可知，排名前10的樣品中，有陜西、浙江、安徽、江蘇產(chǎn)地的樣品各7批、1批、2批、0批；分別占其總樣品數(shù)的46.7%、11.1%、66.7%及0；排名前20的樣品中，陜西、浙江、安徽、江蘇產(chǎn)地的樣品各12、3、3、2批，分別占其總樣品數(shù)的80%、33.3%、100%及66.7%。

表7 不同產(chǎn)地延胡索藥材綜合得分結(jié)果 (n=30)

3 討論

不同產(chǎn)地的延胡索藥材指紋圖譜有16個(gè)共有峰，應(yīng)用質(zhì)譜共指認(rèn)了7個(gè)色譜峰，它們分別為原阿片堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素和紫堇堿。根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰信息，并結(jié)合文獻(xiàn)，在總離子流圖中，保留時(shí)間為19.454 min的色譜峰在一級(jí)質(zhì)譜圖中給出m/z356.187 8，為準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+(C21H25NO4)，推測(cè)其可能為四氫巴馬汀[11-13]；保留時(shí)間為12.077 min的色譜峰在一級(jí)質(zhì)譜圖中給出m/z342.172 7，為準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+(C20H23NO4)，推測(cè)其可能為四氫非洲防己胺[10-14]。

延胡索自然分布在浙江、安徽、江蘇、湖北、河南一帶。500年前開(kāi)始在江蘇茅山栽培，后向南遷移至杭州，最后又向南遷移至浙江中部的東陽(yáng)、磐安一帶，后續(xù)形成有名的“浙八味”之一[15]?，F(xiàn)代所用的元胡絕大部分來(lái)自栽培品，并以浙江東陽(yáng)一帶所產(chǎn)為道地，我國(guó)不少地區(qū)引種栽培都獲得了成功，如陜西、四川等地。陜西引種的延胡索主要分布在陜南漢中一帶，以漢中市城固縣董家營(yíng)村的延胡索栽培為漢中市延胡索引種成功的典范。從相似度、得分圖及綜合得分結(jié)果來(lái)看，三者相互印證，相似度較低的S22樣品，得分圖中較離群，綜合得分較低，排名靠后。從相似度、得分圖可以看出，15批產(chǎn)自陜西的延胡索藥材整體與浙江產(chǎn)地的延胡索較接近，這也間接說(shuō)明陜西漢中市延胡索引種的成功。當(dāng)然，影響中藥材的質(zhì)量是多方面的，比如氣候、環(huán)境、生長(zhǎng)年限以及藥農(nóng)的栽培等因素，所以建立具有專屬性和特征性的評(píng)價(jià)體系是非常有必要的。

本研究通過(guò)全波3D掃描優(yōu)選延胡索藥材指紋圖譜最佳吸收波長(zhǎng)，考察了不同流動(dòng)相系統(tǒng)(乙腈-0.1%磷酸(三乙胺調(diào)pH值至6.0)、乙腈-0.1%磷酸(0.22%三乙胺)、乙腈-1%醋酸-醋酸銨緩沖液(pH6.0))、不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、不同流速(0.7 mL/min、0.8 mL/min、0.9 mL/min、1.0 mL/min)，最終以“柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流速為0.8 mL/min；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸為流動(dòng)相B”色譜條件時(shí)，指紋圖譜色譜峰的分離度、對(duì)稱因子以及峰的個(gè)數(shù)較優(yōu)；考察了不同提取溶劑(水、稀乙醇、70%乙醇、甲醇、濃氨試液-甲醇(1∶20))、提取方式(超聲、回流)、提取時(shí)間(20 min、30 min、40 min)，最終以“稀乙醇為提取溶劑，超聲處理為提取方式，提取30 min”色譜峰的個(gè)數(shù)較多，對(duì)稱因子較好。