劉迪 史濱偉 陶冠男

近些年來(lái)臨床上運(yùn)用牙髓血液重建方法實(shí)現(xiàn)牙髓再生的病例多有報(bào)道[1-4]。牙髓血運(yùn)重建術(shù)是治療口腔疾病的一種新方法，不但對(duì)感染及壞死牙髓具有修復(fù)作用，而且能促使牙本質(zhì)再生。干細(xì)胞、支架和生長(zhǎng)因子分析以及發(fā)展適宜的環(huán)境，都對(duì)牙髓的再生過(guò)程起到不可或缺的重要作用。大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，生長(zhǎng)因子能有效促進(jìn)血管生成[5-6]，誘導(dǎo)根尖形成，但在實(shí)際的牙髓血運(yùn)重建過(guò)程中，這些生長(zhǎng)因子會(huì)有怎樣的變化規(guī)律尚不清楚。本研究方法將對(duì)大鼠可以進(jìn)行保護(hù)牙髓血運(yùn)重建，建立動(dòng)物學(xué)模型，觀察年輕恒牙根組織牙髓再生過(guò)程中的神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endosthort growth factor，VEGF）的表達(dá)能力情況，為牙髓血運(yùn)重建后大鼠牙周組織的炎癥吸收和愈合機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

三氧化物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）（登士柏公司，美國(guó)）；玻璃離子水門?。╣lass-ionomer cement，GIC）；口腔顯微鏡（萊卡公司，德國(guó)）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑（武漢博士德生物公司，中國(guó)）；SD大鼠（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部）。

1.2 研究方法

選取20只3.5周齡SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量60～80 g，雌雄比例各半。隨機(jī)取其中10只作為實(shí)驗(yàn)組。另外10只不作任何處理，以下頜第一磨牙為對(duì)照組。

麻醉劑采用戊巴比妥鈉，腹腔注射。待翻正反射消失后，將SD大鼠固定于鼠板上，用口腔牽拉裝置調(diào)節(jié)大鼠口腔角度，根據(jù)手術(shù)操作需要使其充分暴露口腔術(shù)區(qū)及下頜磨牙區(qū)。

對(duì)SD大鼠下頜第一磨牙進(jìn)行牙髓血運(yùn)重建：首先對(duì)作業(yè)術(shù)野進(jìn)行消毒，用棉卷進(jìn)行隔濕，保持整個(gè)過(guò)程無(wú)菌。用高速不銹鋼球鉆（＃1 / 4）將大鼠下頜第一磨牙的冠部開髓，用生理鹽水沖洗根管腔，然后將手動(dòng)不銹鋼擴(kuò)張針（30）插入根尖孔，使根尖周組織盡可能多地出血，并盡可能多地用血液填充根管。待牙頸部充滿中國(guó)血液時(shí)，將無(wú)菌小棉球蘸濕生理進(jìn)行鹽水后輕微擠干，放置在根管口3～4 mm下；約10 min后，基本形成具有血凝塊，取出小棉球，然后用MTA覆蓋整個(gè)血凝塊表面。最后使用玻璃離子水門?。℅IC）對(duì)其冠部進(jìn)行填充，表面涂布凡士林。填充后，用探針探測(cè)填充邊緣，確認(rèn)填充穩(wěn)定。術(shù)后正常喂食飲水，定期觀察牙冠封閉情況和大鼠健康狀況，如果發(fā)現(xiàn)填充體脫落，重新進(jìn)行填充。

術(shù)后3周將20只大鼠處死，5只實(shí)驗(yàn)組與5只對(duì)照組進(jìn)行分離下頜骨以及對(duì)照，進(jìn)一步進(jìn)行組織學(xué)觀察和影像學(xué)觀察。另外5只實(shí)驗(yàn)組與5只對(duì)照組進(jìn)行VEGF和NGF的熒光光定量qRT－PCR的檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 影像學(xué)觀察 戊巴比妥鈉麻醉，4%多聚甲醛行心臟灌注。灌注后解剖取出下頜骨，放置于4%中性多聚甲醛中，固定24 h后，分別標(biāo)記各個(gè)標(biāo)本。標(biāo)記后，通過(guò)X射線成像系統(tǒng)對(duì)樣本進(jìn)行掃描和成像。

1.3.2 組織學(xué)觀察 戊巴比妥鈉麻醉，4%多聚甲醛行心臟灌注。灌注后解剖分離下頜骨，將多余的硬組織和骨表面軟組織去除后，先放置于15%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），脫鈣在EDTA作用后2個(gè)月內(nèi)進(jìn)行，然后置于常規(guī)乙醇中脫水。石蠟包埋后，通過(guò)根尖孔沿牙齒長(zhǎng)軸（切片厚度4μm）制作切片。

蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取石蠟切片。在68℃～70℃烘烤30分鐘后，脫蠟入水中，HE染色；然后，兩名具有相同標(biāo)準(zhǔn)（Kappa=0.804）的測(cè)試人員在光學(xué)顯微鏡下觀察每個(gè)牙根的組織切片，并根據(jù)以下參數(shù)和組織學(xué)類型進(jìn)行評(píng)估。

參數(shù)分別為：（1）是否在管腔及根尖周圍環(huán)境存在大量的炎癥反應(yīng)細(xì)胞；（2）是否在牙根牙本質(zhì)內(nèi)壁上有新生硬組織；（3）是否在根尖有硬組織沉積，令牙根長(zhǎng)度可以增加；（4）根尖是否能夠存在一個(gè)閉合的趨勢(shì)；（5）是否在根管內(nèi)存在一些新生的組織。

1.3.3 qRT－PCR檢測(cè) 戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，多聚甲醛心臟灌注之前，在每一側(cè)下頜骨的根管內(nèi)組織及根尖周組織，收集到1個(gè)去RNA酶的微型離心管（eppendorf，EP）管，待降溫后，將其放入液氮中，并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中。提取組織總RNA，進(jìn)行qRT－PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)，每個(gè)樣本有3個(gè)平行復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 24.0軟件和GraphPad Prism 8軟件對(duì)上述檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間是否存在差異，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)觀察結(jié)果

X光片結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組下頜第一磨牙根尖陰影增大，管壁增厚，形成一定數(shù)量的新的高密度硬組織，牙根仍發(fā)育。對(duì)照組大鼠下頜第一磨牙牙體完整，根尖周圍未發(fā)現(xiàn)存在明顯異常，牙根沒(méi)有在系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中完成，根管口成喇叭狀。

2.2 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠下頜第一磨牙管腔及根管存在炎性細(xì)胞，牙根本質(zhì)內(nèi)壁上有新生硬組織生成，根尖有組織沉積，牙根長(zhǎng)度增加，發(fā)生改變。根管內(nèi)存在大量新生的組織，并且根尖有進(jìn)一步閉合的趨勢(shì)，牙根繼續(xù)發(fā)育。對(duì)照組大鼠下頜第一磨牙管腔及根管不存在炎性細(xì)胞，牙髓為疏松結(jié)締組織，位于牙本質(zhì)組成的髓腔內(nèi)，根尖呈現(xiàn)尚未完全閉合狀態(tài)。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組VEGF的mRNA的表達(dá)比對(duì)照組高很多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001 7＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組NGF的mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039 7＜0.05）。如圖1所示。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)VEGF與NGF相對(duì)表達(dá)量結(jié)果示意圖

3 討論

近年來(lái)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endosthort growth factor，VEGF）的研究較多，它是1989年分離純化出來(lái)的一類糖蛋白。是重要的血管源性生長(zhǎng)因子，具有兩大突出的生物學(xué)特性：一方面，它可顯著增加血管通透性，是目前己知最強(qiáng)的血管通透性因子之一[7]。另一方面，它是一種強(qiáng)大的血管生成誘導(dǎo)劑，在炎癥及創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，可激活內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)新生血管形成[8]。有研究[9]顯示VEGF在多種組織的損傷后修復(fù)過(guò)程中起作用。本實(shí)驗(yàn)中，血運(yùn)重建術(shù)后大鼠牙髓根部的VEGF的qRT-PCR結(jié)果顯示，VEGF的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001 7＜0.05）。結(jié)合影像學(xué)與組織學(xué)觀察結(jié)果，提示牙髓血管通透性的增加和炎性細(xì)胞的積聚是由VEGF產(chǎn)物的上調(diào)引起的。該產(chǎn)品還可以增加牙髓血運(yùn)重建過(guò)程中的血管內(nèi)壓力，加速炎癥的發(fā)展。同時(shí)，VEGF產(chǎn)物可以保證了牙髓細(xì)胞組織血供充足，增加了患者血管通透性，益于組織進(jìn)行修復(fù)。鑒于損傷愈合的2大典型特征：血管通透性增加和血管生成都因VEGF產(chǎn)物上調(diào)而出現(xiàn)，因此VEGF在牙髓血運(yùn)重建過(guò)程中起到重要作用。

神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）是一種多功能生長(zhǎng)因子，促進(jìn)中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)的發(fā)育、分化和生長(zhǎng)，其功能不斷地被學(xué)者們深入探討研究[10]。越來(lái)越多的學(xué)者通過(guò)研究NGF在不同的組織、器官（如大腦[11]、肝臟[12]、坐骨神經(jīng)[13]、皮膚[14]等）中的作用發(fā)現(xiàn)，其與組織炎癥的發(fā)生和損傷時(shí)伴發(fā)的痛覺(jué)過(guò)敏密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，血運(yùn)重建術(shù)后大鼠牙髓根部的NGF的qRT-PCR結(jié)果顯示，NGF的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039 7＜0.05）。說(shuō)明NGF參與牙髓血運(yùn)重建的調(diào)控，在牙齒受到損傷或炎癥感染后牙髓組織中NGF表達(dá)水平升高，牙髓局部NGF濃度的升高不僅可以促進(jìn)牙髓損傷處感覺(jué)神經(jīng)纖維再生，還可導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生，刺激牙髓細(xì)胞分化為牙本質(zhì)，促進(jìn)礦化形成[15]；NGF本身也可促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖和向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化[16]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠下頜第一磨牙牙髓血運(yùn)重建模型，利用影像學(xué)、組織學(xué)及qRT-PCR等方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，在年輕恒牙牙髓血運(yùn)重建過(guò)程中，其根部組織VEGF、NGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加。