呂紅玲，劉春林，鄧德耀，徐紅云

云南省第二人民醫(yī)院/云南大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，云南昆明 650000

喹諾酮類藥物是一類人工合成的抗菌藥物，具有抗菌譜廣、活性強(qiáng)、安全、廉價等優(yōu)點，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有良好的抗菌活性，被廣泛應(yīng)用于各種細(xì)菌感染的治療。但近年來，隨著喹諾酮類抗菌藥物的廣泛及不合理使用，細(xì)菌耐藥性逐漸增加[1]，給臨床治療帶來較大困難。本研究對本院2015-2019年臨床分離的病原菌菌群分布，以及主要病原菌對常用喹諾酮類抗菌藥物(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星)的耐藥狀況進(jìn)行回顧性分析，旨在為醫(yī)院感染監(jiān)控和臨床合理使用喹諾酮類抗菌藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集云南省第二人民醫(yī)院2015-2019年住院及門診患者進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的各類標(biāo)本的臨床數(shù)據(jù)，包括標(biāo)本種類、菌種鑒定及藥敏情況，剔除同一患者同一部位重復(fù)菌株數(shù)據(jù)。

1.2儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀、革蘭陰性菌鑒定卡(GN卡)、革蘭陽性菌鑒定卡(GP卡)、革蘭陰性菌藥敏卡(ASTGN卡)、革蘭陽性菌藥敏卡(ASTGP卡)均購自法國生物梅里埃公司；抗菌藥敏紙片購自英國OXOID公司；藥敏試驗用MH瓊脂購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.3細(xì)菌鑒定和藥敏試驗 按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌接種、培養(yǎng)、分離、鑒定和藥敏試驗，菌株鑒定和藥敏試驗采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀及相應(yīng)藥敏卡。藥敏結(jié)果判斷參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，必要時采用手工生化復(fù)核鑒定結(jié)果、紙片擴(kuò)散法復(fù)核藥敏結(jié)果。

1.4腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶檢測 采用改良Hodge試驗，用生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的大腸埃希菌ATCC25922(指示菌)菌懸液，再用生理鹽水1∶10稀釋，根據(jù)常規(guī)紙片擴(kuò)散法程序接種于MH平板，干燥3～10 min，在平板中心貼10 μg厄他培南紙片，使用10 μL接種環(huán)挑取血瓊脂平板過夜生長的3～5個試驗菌落，從紙片邊緣向外劃直線，劃線約20～25 mm。35 ℃培養(yǎng)16～20 h，孵育后，檢查MH平板，在抑菌圈與試驗菌株劃線交叉處出現(xiàn)增強(qiáng)生長現(xiàn)象的為碳青霉烯酶陽性；采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀對產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)及耐甲氧西林葡萄球菌進(jìn)行鑒定，必要時采用K-B紙片擴(kuò)散法確認(rèn)。

1.5質(zhì)控菌株 采用大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、糞腸球菌ATCC29212和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株，均購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用WHONET5.6軟件進(jìn)行耐藥率統(tǒng)計，采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株來源 2015-2019年共分離到27 663株非重復(fù)致病菌株，主要分離自呼吸道痰10 338株(37.37%)、創(chuàng)口分泌物/組織7 428株(26.85%)、血液3 770株(13.63%)和尿液2 824株(10.21%)，其他標(biāo)本(胸腔積液、腹水、膽汁、生殖道分泌物和腦脊液等)3 303株(11.94%)。主要來源于ICU、普外科、創(chuàng)傷外科和神經(jīng)外科等臨床科室。

2.2病原菌分布 27 663株病原菌中革蘭陰性菌共20 931株(75.66%)，革蘭陽性菌6 732株(24.34%)。排列居前5位的腸桿菌科細(xì)菌和前5位的非發(fā)酵菌共18 548株，占全部革蘭陰性菌總數(shù)的88.61%。排列居前5位的革蘭陽性菌共4 994株，占全部革蘭陽性菌總數(shù)的74.18%，見表1。

表1 病原菌分布情況

2.3病原菌對喹諾酮類藥物的耐藥情況 主要腸桿菌科細(xì)菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況見表2；主要非發(fā)酵菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況見表3；主要革蘭陽性菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況見表4。

表2 主要腸桿菌科細(xì)菌對2種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況

表3 主要非發(fā)酵菌對2種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況

表4 主要革蘭陽性菌對3種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況(%)

2.4特殊菌株耐藥情況 分別檢測出產(chǎn)碳青霉烯酶的大腸埃希菌(CPEC)48株(0.70%)和產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌(CPKP)584株(13.90%)。CPEC、CPKP對2種喹諾酮類抗菌藥物(環(huán)丙沙星和左氧氟沙星)的耐藥率明顯高于不產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表5。分離到產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌4 233株(61.96%)和產(chǎn)ESBL的肺炎克雷伯菌1 383株(32.92%)，產(chǎn)ESBL的菌株對2種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBL的菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表6。分離到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)761株(32.55%)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)658株(72.55%)，甲氧西林耐藥的葡萄球菌對3種喹諾酮類抗菌藥物(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星)的耐藥率明顯高于甲氧西林敏感菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表7。

表5 產(chǎn)或不產(chǎn)碳青霉烯酶的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌對2種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況(%)

表6 產(chǎn)或不產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌對2種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況(%)

表7 耐甲氧西林的葡萄球菌與甲氧西林敏感的葡萄球菌對3種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況(%)

3 討 論

本研究耐藥性分析結(jié)果顯示，在所有分離的病原菌中，喹諾酮類抗菌藥物耐藥率最高的前3位細(xì)菌分別為屎腸球菌(77.7%～90.8%)、鮑曼不動桿菌(42.1%～74.4%)和大腸埃希菌(49.0%～55.5%)。與同期CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測報道的全國平均水平相比，腸桿菌科細(xì)菌中大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率與全國平均水平相近；非發(fā)酵菌中銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均高于全國平均水平，鮑曼不動桿菌對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率與全國平均水平相近，嗜麥芽窄食單胞菌對左氧氟沙星的耐藥率(17.8%～33.3%)高于全國平均水平(9.0%～11.7%)[2-6]，提示本院銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥形勢嚴(yán)峻；革蘭陽性菌中金黃色葡萄球菌對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的耐藥率均呈逐年降低趨勢，從2015年明顯高于全國平均水平，至2017年與全國平均水平相近，到2018年低于全國平均水平[7-8]；屎腸球菌對上述3種抗菌藥物的耐藥率均在77%以上，與全國平均水平相近[7-8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，CPEC和CPKP對2種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率均明顯高于CNEC、CNKP；產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌對2種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率均明顯高于不產(chǎn)ESBL的菌株；甲氧西林耐藥的葡萄球菌對3種喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率明顯高于甲氧西林敏感菌株，提示產(chǎn)碳青霉烯酶和產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌，甲氧西林耐藥的葡萄球菌均具有較高的喹諾酮類耐藥基因攜帶率。研究報道，耐碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌可攜帶多種耐藥基因，其中喹諾酮類的耐藥基因具有較高的攜帶率[9-10]；產(chǎn)ESBL的腸桿菌科細(xì)菌對喹諾酮類抗菌藥物普遍耐藥[11-12]；質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因與AmpC β-內(nèi)酰胺酶，ESBL和碳青霉烯酶相關(guān)，它們攜帶的基因位于具有多重耐藥性的同一接合質(zhì)粒上[9]；MRSA的氟喹諾酮類耐藥基因攜帶率高于MSSA[13]，這些現(xiàn)象致使由這些微生物引起的各種感染性疾病的治療更加復(fù)雜。早在2009年《喹諾酮類抗菌藥在感染病治療中的適應(yīng)證及其合理應(yīng)用：專家共識》就提到MRSA所致感染不宜選用氟喹諾酮類抗菌藥物[14]；2015年《多重耐藥菌醫(yī)院感染預(yù)防與控制中國專家共識》中提到氟喹諾酮類不適于產(chǎn)ESBL腸桿菌科細(xì)菌的經(jīng)驗性治療，可作為重癥感染的聯(lián)合治療[15]；目前治療產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌感染的藥物主要為多黏菌素、替加環(huán)素、頭孢他啶-阿維巴坦、磷霉素和氨基糖苷類[16]。本院2015-2019年CPEC檢出率為0.70%，CPKP檢出率為13.90%，產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌檢出率為61.96%，產(chǎn)ESBL的肺炎克雷伯菌檢出率為32.92%，MRSA檢出率為32.55%，MRSE檢出率為72.55%，值得注意的是MRSA對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥率均>70%，明顯高于CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測研究結(jié)果(環(huán)丙沙星檢出率為32.7%，左氧氟沙星檢出率為34.0%)[8]。所以，動態(tài)監(jiān)測細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性變化，并對重點細(xì)菌耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，掌握細(xì)菌耐藥流行趨勢，有助于指導(dǎo)臨床合理用藥。

細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，主要是由染色體介導(dǎo)的靶位點拓?fù)洚悩?gòu)酶的改變和細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積的減少，以及由可傳遞質(zhì)粒所編碼的Qnr蛋白的保護(hù)機(jī)制所致[17]。喹諾酮類抗菌藥物耐藥菌株的產(chǎn)生有醫(yī)源性、動物源性和食物源性，有關(guān)研究報道，醫(yī)院喹諾酮類、頭孢菌素和四環(huán)素的使用概率與大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥的發(fā)生率呈正相關(guān)[18]；左氧氟沙星使用概率與銅綠假單胞菌、克雷伯菌屬、金黃色葡萄球菌和腸桿菌屬耐藥率均呈高度正相關(guān)[19]；但也有研究報道左氧氟沙星使用概率與大腸埃希菌的耐藥率呈負(fù)相關(guān)[20]，提示喹諾酮類藥物用量與其耐藥的關(guān)系非常復(fù)雜，仍需深入研究。要減少多藥耐藥菌株的產(chǎn)生，應(yīng)注意合理使用抗菌藥物。此外，喹諾酮類藥物由于安全性高、價格低廉等優(yōu)點被廣泛運用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，一方面它可直接導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生，另一方面它通過食物鏈進(jìn)而促使人體內(nèi)部菌群的耐藥性產(chǎn)生。

綜上所述，本院喹諾酮類抗菌藥物耐藥率最高的前3位細(xì)菌分別為屎腸球菌、鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌，但與CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)報道的耐藥率相比，銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌和MRSA對喹諾酮類抗菌藥物耐藥形勢較為嚴(yán)峻。臨床醫(yī)生應(yīng)嚴(yán)格掌握喹諾酮類藥物使用的適應(yīng)證，關(guān)注當(dāng)?shù)蒯t(yī)院的細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀和變化趨勢，嚴(yán)格控制細(xì)菌耐藥率較高的抗菌藥物的臨床使用，以減少抗菌藥物的選擇性壓力；動態(tài)監(jiān)測臨床常見病原菌對喹諾酮類藥物的耐藥性變化，了解耐藥機(jī)制的產(chǎn)生，指導(dǎo)臨床合理用藥，最大限度發(fā)揮喹諾酮類藥物的作用。