蘇培淵，楊 清，付 兵，陳岳威，黃文輝

成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院胸心外科，四川成都 610075

肺癌是全球范圍內(nèi)對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其死亡率位居惡性腫瘤的首位[1-2]。肺癌患者中約有85%的患者為非小細胞肺癌，其中約50%的非小細胞肺癌患者組織病理學分類屬于肺腺癌(LUAD)，約30%的患者組織病理學分類屬于肺鱗狀細胞癌(LUSC)。LUAD和LUSC在轉錄組水平、細胞網(wǎng)絡調(diào)控、預后特征及治療反應中的表現(xiàn)明顯不同[3-4]。因此，準確區(qū)分這2種亞型對于肺癌的診斷和治療尤為重要。

近年來，隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展和提高，肺癌的治療模式已從依據(jù)分期制訂治療方案的模式轉變?yōu)橐罁?jù)基因組學、組織學分類制訂精準治療方案的先進治療模式。因此，如何精準鑒別LUAD和LUSC，對肺癌的靶向治療起到關鍵作用。目前，LUAD和LUSC實驗室的鑒別診斷常見標志物主要為甲狀腺轉錄因子-1(TTF-1)、新天門冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、腫瘤蛋白p63(TP63)、細胞角蛋白(CK)5/6/7，其對肺癌鑒別診斷的準確率可達到75%以上[3,5]。然而，現(xiàn)有的實驗室標志物對肺癌鑒別診斷準確率仍然無法讓臨床滿意，需要發(fā)現(xiàn)新的、更高診斷準確率的標志物用于肺癌的鑒別診斷。

鈣調(diào)蛋白樣蛋白3(CALML3)是一種鈣敏感蛋白，其對細胞黏附和運動起重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)CALML3在乳腺癌、胃癌、肝癌中作為抑癌基因，在腫瘤組織中表達明顯降低[6]。CHEN等[6]通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，CALML3在LUAD和LUSC中表達升高，且能夠作為有效鑒別區(qū)分LUAD和LUSC的免疫組化標志物。但CALML3 mRNA在肺癌組織的表達情況，以及能否作為一個定量生物標志物有效區(qū)分LUAD和LUSC還有待研究。

本研究系統(tǒng)地對癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中CALML3測序數(shù)據(jù)進行綜合分析，探討CALML3 mRNA在LUAD和LUSC中的表達水平、預后價值，以明確CALML3作為區(qū)分LUAD和LUSC的候選標志物的可能。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3—12月在本院胸心外科接受根治性手術的肺癌患者，年齡42～72歲，中位年齡56歲，收集患者相關資料如性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分期、腫瘤亞型及淋巴結轉移程度等。手術留取其癌組織及其癌旁正常組織標本(距離腫瘤邊緣5 cm以上)。納入標準：標本收集前患者均未接受過手術治療、化療或放療，且均通過病理學檢查確診為肺癌。排除標準：多發(fā)腫瘤，腫瘤原發(fā)病灶不能明確，其他器官腫瘤轉移至肺部者。最終選取50例LUAD患者和50例LUSC患者納入研究。本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準，且所有參與本研究患者均已簽署知情同意書。

1.2UALCAN和GEPIA數(shù)據(jù)庫差異表達基因分析 采用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫分析TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD和LUSC實體瘤和相對于癌旁正常組織中差異基因的表達情況，以改變倍數(shù)|log2FC|≥1，P<0.05為標準。

1.3組織RNA的提取與實時熒光定量PCR(qPCR)擴增 采用Trizol提取試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)提取組織RNA，PrimeScriptTMRTⅡ反轉錄試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)將RNA反轉錄為cDNA。通過Primer-blast對CALML3和GADPH進行在線引物設計。CALML3正向：5′-TGGATGAGCAGGGGATGAGA-3′，反向：5′-GCTGCCAGCGTATCCATTTG-3′；GADPH正向：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，反向：5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。采用SYBR?Premix Ex TaqⅡ試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)進行PCR擴增，反應總體積20 μL，反應條件：預變性95 ℃ 30 s后，進行40個循環(huán)反應(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)。應用ABI 7500 Fast Real-time PCR擴增儀檢測每個擴增循環(huán)后SYBR?Green熒光信號水平，運用溶解曲線檢測擴增產(chǎn)物純度。采用相對定量2-ΔΔCt的方法計算CALML3 mRNA的相對表達水平。

2 結 果

2.1CALML3在LUAD和LUSC中的表達情況 通過使用UALCAN數(shù)據(jù)庫對TCGA數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)CALML3在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種類型的實體瘤中表達降低，而在LUAD、LUSC及宮頸鱗狀細胞癌等腫瘤中表達升高。CALML3在LUSC組織中相對表達水平為436.059(105.149，904.051)，明顯高于癌旁正常組織[0.447(0.143，0.810)]，約為癌旁正常組織的975倍(P<0.05)，見圖1A。CALML3在LUAD組織中相對表達水平為0.061(0.000，0.175)，是癌旁正常組織[0.032(0.000，0.093)]的1.9倍(P=0.003)，見圖1B。與相對應癌旁正常組織相比，CALML3在LUSC中的改變倍數(shù)是在LUAD中的7 149倍。由于設定小于改變倍數(shù)閾值(|log2FC|≥1)，即改變倍數(shù)≥2具有差異，而CALML3在LUAD組織中的相對表達水平僅為癌旁正常組織的1.9倍，因此CALML3在LUAD組織中的相對表達水平相對于癌旁正常組織沒有明顯的改變。

注：A為CALML3在LUSC中的表達情況；B為CALML3在LUAD中的表達情況。

為了進一步確認CALML3在LUAD和LUSC中的表達情況，采用GEPIA對TCGA數(shù)據(jù)進行提取分析，發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，CALML3在LUSC組織中表達明顯升高，而在LUAD組織中表達無明顯差異，與UALCAN分析結果一致，見圖2。

圖2 CALML3在LUAD和LUSC中的表達情況

2.2CALML3與LUSC、LUAD的臨床特征分析 LUSC患者性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分期及淋巴結轉移程度對CALML3的相對表達水平?jīng)]有影響(P>0.05)。CALML3在61～80歲的LUAD患者中相對表達水平[0.061(0.000，0.175)]高于21～40歲的LUAD患者[0.041(0.036，0.046)]，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。此外，LUAD患者的淋巴結轉移程度對CALML3的相對表達水平有影響(P<0.05)，然而腫瘤分期、性別和吸煙情況對CALML3的相對表達水平?jīng)]有影響(P>0.05)。

2.3CALML3與LUSC、LUAD患者生存情況的相關性分析 CALML3與LUSC、LUAD患者總體生存期(OS)和無病生存期(DFS)不具有相關性(P>0.05)。

2.4CALML3對LUSC和LUAD的鑒別作用 CALML3在LUSC組織中的相對表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3A。CALML3在LUAD組織中的相對表達水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3B。CALML3在LUAD組織中的相對表達水平明顯低于LUSC組織(LUSC/LUAD=3.653)。

注：A為CALML3在LUSC組織中的表達情況；B為CALML3在LUAD組織中的表達情況。

2.5CALML3對LUSC和LUAD的診斷價值 以LUAD為對照，CALML3診斷LUSC的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)為0.837，95%CI：0.753～0.922，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。當最佳臨界值為2.155時，其靈敏度為0.720(95%CI：0.575～0.838)，特異度為0.860(95%CI：0.733～0.942)。見圖4。

圖4 CALML3鑒別診斷LUSC和LUAD的ROC曲線

3 討 論

肺癌的主要病理類型為LUAD和LUSC，然而它們的分子生物學特征、治療方法和治療結果存在很大差異，因為其靶向治療取決于組織學的精準分型，因此準確判斷非小細胞肺癌患者的分型，對患者靶向治療方案的確定至關重要[7]。

有研究發(fā)現(xiàn)，橋粒芯蛋白3和橋粒膠連蛋白3為潛在的LUSC生物標志物[7]。雖然其在鑒別診斷非小細胞肺癌上具有一定的優(yōu)勢，但仍有許多確診的肺癌病例對LUAD和LUSC標志物呈雙陽性現(xiàn)象[7]。因此，尋找更為準確且能夠完全有效區(qū)分LUAD和LUSC的分子診斷標志物，對于LUAD和LUSC的鑒別和治療尤為重要。

CALML3是一種鈣依賴性細胞黏附分子跨膜糖蛋白編碼基因，其作為肌球蛋白10的調(diào)節(jié)劑，能夠與肌球蛋白10競爭性結合，對細胞黏附和運動起重要調(diào)控作用。CALML3已被證實可作為乳腺癌、胃癌、肝細胞癌的新型生物標志物和治療靶點[6,8]。然而，CALML3在肺癌中的表達情況知之甚少。為了明確CALML3在腫瘤中的表達情況，本研究通過UALCAN 和GEPIA兩大數(shù)據(jù)庫對TCGA數(shù)據(jù)提取分析，發(fā)現(xiàn)CALML3在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤中表達降低，而在LUSC及宮頸鱗狀細胞癌等腫瘤中表達升高，這說明CALML3在肺癌發(fā)生發(fā)展進程中起著癌基因的作用。

CALML3與腫瘤的侵襲轉移相關[8]。CALML3作為肝癌的抑制劑可在體外和體內(nèi)抑制肝癌的癌變和轉移進程的激活，同時高表達的CALML3對肝癌生長和肺轉移有明顯的抑制作用[8]。本研究對CALML3在LUSC和LUAD中的表達水平與臨床特征進行分析，發(fā)現(xiàn)LUSC患者的性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分期及淋巴結轉移程度對CALML3的相對表達水平?jīng)]有影響，而LUAD患者的年齡、淋巴結轉移程度對CALML3的相對表達水平有影響。但其具體機制尚不清楚，后續(xù)將深入探究。

CALML3除了參與腫瘤侵襲轉移進程外，還與腫瘤預后明顯相關。LIANG等[9]發(fā)現(xiàn)低表達的CALML3與CALML3甲基化及胃癌患者OS呈正相關。LI等[10]對基于TCGA的RNA測序和甲基化數(shù)據(jù)進行綜合分析并建立肝癌預后風險模型，同樣發(fā)現(xiàn)CALML3甲基化程度和表達水平與肝癌患者預后具有相關性。為了明確CALML3表達水平是否與肺癌患者預后具有相關性，本研究采用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CALML3與LUSC、LUAD患者的OS和DFS不具有相關性。

CALML3在LUSC和LUAD中的鑒別作用報道極少，且其在肺癌中的表達和功能更鮮為人知。ZHAN等[3]通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中的RNA測序數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，CALML3在LUSC中表達水平改變倍數(shù)相當于LUAD的71.17倍，且CALML3鑒別LUSC和LUAD的AUC為0.964。隨后ZHAN等[3]進一步通過免疫組化染色對CALML3進行分析發(fā)現(xiàn)，CALML3在LUSC和LUAD中的表達分布明顯不同，CALML3鑒別LUSC、LUAD的靈敏度和特異度分別為90%和98%。為了進一步驗證CALML3在LUSC和LUAD中的表達情況，以及CALML3對LUSC和LUAD的鑒別作用，本研究通過qPCR對LUSC和LUAD組織中的CALML3 mRNA進行檢測發(fā)現(xiàn)，CALML3在LUSC組織和LUAD組織中的相對表達水平高于其癌旁正常組織，且CALML3在LUSC組織中的相對表達水平改變倍數(shù)是LUAD組織的3.653倍。此外，本研究發(fā)現(xiàn)CALML3在LUSC中的AUC為0.837，靈敏度為0.720，特異度為0.860，其能夠作為鑒別LUSC和LUAD的潛在生物標志物。

綜上所述，CALML3可作為鑒別LUSC和LUAD的一個潛在的生物標志物，但其在肺癌中的表達、功能及臨床實用價值有待進一步研究。后期也將繼續(xù)研究CALML3在肺癌患者血液及其他體液中的潛在價值，以明確CALML3的實際臨床應用，以及能否作為一個無創(chuàng)的生物標志物用于肺癌亞型的鑒別診斷。