鄧順順，梁國朝，高永雙

廣東省中山市第三人民醫(yī)院檢驗科，廣東中山 528400

血藥濃度受患者基因多態(tài)性、并發(fā)疾病、肝腎功能改變、藥物劑型、藥物相互作用及高蛋白飲食等眾多因素的影響，從而使得常規(guī)用藥可能導(dǎo)致不同患者出現(xiàn)不同的臨床療效[1]。治療藥物監(jiān)測是針對不同患者個體，針對性制訂給藥方案的一種有效方法[2]。非典型抗精神病藥物利培酮是目前臨床廣泛使用的一線治療藥物，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于苯并異噁唑類衍生物，是5-羥色胺的選擇性拮抗劑和多巴胺D2受體[3-5]。對于首發(fā)精神分裂癥患者仍多選擇藥物治療，其中氯氮平、利培酮、阿立哌唑均是比較常見的藥物[6]。精神分裂癥的患者需要長期使用藥物維持治療，以減輕精神癥狀，控制疾病發(fā)作[7]?？咕癫∷幬镆鸬难?、血脂代謝紊亂，是心腦血管疾病、糖尿病等多種疾病潛在的生物學(xué)危險因素[8]。利培酮在肝臟經(jīng)9-羥基化、N-去甲基化等途徑代謝，主要代謝產(chǎn)物為九羥利培酮，與利培酮具有相同的活性[9]。九羥利培酮血漿消除半衰期較長，對服用利培酮的患者進(jìn)行治療藥物監(jiān)測時，需要同時檢測利培酮和九羥利培酮。因此，同時檢測利培酮與九羥利培酮能準(zhǔn)確反映療效和不良反應(yīng)發(fā)生率[10]。

本研究對本實驗室同時開展的液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜(LC-MS/MS)法和高效液相色譜(HPLC)法檢測利培酮和九羥利培酮血藥濃度進(jìn)行性能驗證，在驗證合格的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對比LC-MS/MS和HPLC兩種方法的檢測結(jié)果，以觀察結(jié)果的差異性，確定實驗室檢測方案。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 島津LCMS-8040三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀，Agilent-1200高效液相色譜分析儀，Eppendorf-5424R臺式低溫高速離心機，Eppendorf移液槍，上海安亭低速離心機，上海醫(yī)大渦旋混合器，帕恩特-XYB-H普通分析級純水機，昆山KQ-300DV超聲波清洗器，德國塞多利斯BT25S十萬分之一分析天平，常熟百靈LP1002型1/100電子天平，中科美菱DW-HL218超低溫冰箱。LC-MS/MS法檢測試劑：水相、有機相、內(nèi)標(biāo)母液、稀釋劑1、標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑均購自深圳品生公司。HPLC法檢測試劑：利培酮購自西安楊森制藥有限公司，9-羥利培酮、曲唑酮購自美國SIGMA公司，甲醇、乙腈(色譜純)購自德國默克公司，水為去離子水。

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本處理 靜脈血5 mL室溫凝固后以4 000 r/min離心5 min，分離出的上清液為血清標(biāo)本，進(jìn)行第一次檢測之后，將剩余的血清標(biāo)本吸取約1.5 mL保存到小型離心管中，-20 ℃冰箱保存。將凍存于-20 ℃冰箱的標(biāo)本拿出，放置于室溫，復(fù)融后開始檢測，每個標(biāo)本只復(fù)融一次，避免反復(fù)凍融可能影響檢測結(jié)果。

1.2.2色譜與質(zhì)譜條件 LC-MS/MS法：預(yù)柱(Phenomenex，Security Guard Ultra Cartridges，AJ0-8775)，色譜柱(Phenomenex，Kinetex XB-C18，2.6 μm，3 mm×50 mm)；二元高壓梯度洗脫，流速為0.4 mL/min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量5 μL，采用電噴霧電離化(ESI)，正離子模式，加熱模塊溫度為450 ℃，脫溶劑管溫度200 ℃，噴氣壓力為230 kPa，流速20.0 L/min；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描。HPLC法：色譜柱為Eclipse Plus C18柱(150.0 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國Agilent)，流動相(甲醇∶乙腈∶水為1.5∶1.7∶6.2)；每100 mL流動相中加入0.85 mL正丁胺，0.85 mL冰乙酸；流速為1.0 mL/min。

1.2.3穩(wěn)定性試驗 用質(zhì)控血清標(biāo)本(低、中、高3個濃度)各3份，檢測其在-20 ℃ 保存1、14、31 d的穩(wěn)定性。

1.2.4批內(nèi)精密度 在同一天內(nèi)，使用低、中、高3個濃度的標(biāo)本分別進(jìn)行5次獨立測試。

1.2.5批間精密度 使用低、中、高3個濃度標(biāo)本，每天分別進(jìn)行5次獨立測試，檢測3 d，共獲得45個測試數(shù)據(jù)。

1.2.6線性范圍驗證試驗 配制8個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，在1個分析批內(nèi)，對每個濃度點重復(fù)檢測2次，進(jìn)行線性回歸分析，評價峰面積比值與濃度之間的線性關(guān)系，并計算檢測濃度與已知濃度的偏差。

1.2.7提取回收率試驗 在空白血清標(biāo)本中加入不同體積標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)準(zhǔn)溶液體積應(yīng)少于總體積的10%)，制備3個濃度的標(biāo)本(標(biāo)本終濃度在測量區(qū)間內(nèi))。每個標(biāo)本重復(fù)檢測3次計算均值濃度、回收率。

1.2.8比對試驗 用LC-MS/MS法和HPLC法檢測同一例患者血清標(biāo)本，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。分段收取本院住院患者常規(guī)檢測利培酮和九羥利培酮血藥濃度標(biāo)本共60份。每份標(biāo)本當(dāng)天檢測一次并發(fā)放報告，將剩余血清吸出，置于1.5 mL小型離心管中，保存在-20 ℃冰箱中，30 d內(nèi)用另一種方法檢測，對兩種方法檢測出的相同標(biāo)本的結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1性能試驗驗證結(jié)果 質(zhì)控品在-20 ℃保存1、14、31 d的條件下，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均<15%，結(jié)果穩(wěn)定。

LC-MS/MS法：利培酮低、中、高濃度(20、100、160 ng/mL)血清標(biāo)本的提取回收率分別為105.72%、102.06%，101.27%；九羥利培酮低、中、高濃度(100、500、800 ng/mL)血清標(biāo)本的提取回收率分別為92.06%、95.17%，102.29%。利培酮的線性范圍為1.07～203.23 ng/mL，九羥利培酮的線性范圍為5.60～1 033.34 ng/mL，最大允許偏差均<15%，r2均≥0.99。

HPLC法：利培酮低、中、高濃度(4、16、48 ng/mL)血清標(biāo)本的提取回收率分別為110.0%、91.9%，107.5%；九羥利培酮低、中、高濃度(10、40、120 ng/mL)血清標(biāo)本的提取回收率分別為90.0%、104.0%，110.3%。利培酮的線性范圍為2.52～57.65 ng/mL，九羥利培酮的線性范圍為5.39～141.23 ng/mL，r2均≥0.99。

兩種方法的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均<15%，精密度良好。性能驗證試驗均通過。

2.2利培酮/九羥利培酮HPLC法與LC-MS/MS法檢測結(jié)果比較 Shapiro-Wilk法顯示LC-MS/MS法與HPLC法檢測結(jié)果均呈正態(tài)分布。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示利培酮HPLC法與LC-MS/MS法結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.984，P<0.05)，九羥利培酮HPLC法與LC-MS/MS法結(jié)果也呈正相關(guān)(r=0.949，P<0.05)。檢測結(jié)果比較見表1。以LC-MS/MS法檢測結(jié)果為橫坐標(biāo)，HPLC法檢測結(jié)果為縱坐標(biāo)分別繪制的散點圖見圖1。

表1 利培酮/九羥利培酮HPLC法與LC-MS/MS法檢測結(jié)果比較

注：A為檢測利培酮結(jié)果的散點圖；B為檢測九羥利培酮結(jié)果的散點圖。

2.3利培酮/九羥利培酮HPLC法與LC-MS/MS法檢測結(jié)果的偏差圖 根據(jù)Bland-Altman偏差圖可以得知，LC-MS/MS法檢測利培酮與九羥利培酮的結(jié)果分別比HPLC法檢測結(jié)果高1.97 ng/mL和1.38 ng/mL，95%置信區(qū)間分別為-5.81～9.74、-10.28～11.66，見圖2、3。

圖2 LC-MS/MS法和HPLC法檢測患者九羥利培酮濃度結(jié)果的Bland-Altman偏差圖

圖3 LC-MS/MS法和HPLC法檢測患者利培酮濃度結(jié)果的Bland-Altman偏差圖

3 討 論

本研究LC-MS/MS法采用的是品生公司提供的操作方法和試劑，HPLC法采用的是自配試劑，兩種方法檢測利培酮與九羥利培酮均采用同位素內(nèi)標(biāo)法，通過測量內(nèi)標(biāo)物及被測組分的峰面積相對值來進(jìn)行結(jié)果計算，經(jīng)驗證兩種方法均能很好地應(yīng)用于利培酮和九羥利培酮血藥濃度的檢測中。HPLC由儲液罐、高壓輸液泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測器、記錄儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成[12]。LC-MS/MS法是將HPLC與質(zhì)譜分別作為分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)，待測試樣在HPLC部分經(jīng)過分離后，進(jìn)入質(zhì)譜部分，標(biāo)本與流動相分離后，經(jīng)離子源對標(biāo)本進(jìn)行離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度，從而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法[13]。所以LC-MS/MS法是集HPLC法的高分離效能與質(zhì)譜的高鑒定性能于一體，靈敏度較傳統(tǒng)的HPLC法高3～4個數(shù)量級，對研究對象有足夠的靈敏度、選擇性，能分析更多的物質(zhì)，分析能力更好。

近幾年，LC-MS/MS法不斷發(fā)展，由于其具有高效的色譜分離和專屬特異的質(zhì)譜檢測等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)本的分析[14]。隨著色譜分析技術(shù)越來越多地運用于臨床檢測當(dāng)中，實驗室類似設(shè)備越來越多，根據(jù)需求會開展不同或者同一項目，比對分析已經(jīng)成為日常檢測質(zhì)量控制中的重要一環(huán)。依據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》要求實驗室內(nèi)采用不同方法或儀器檢驗的同一項目，應(yīng)進(jìn)行一致性比較，定期實施比對(至少每年一次)及時解決比對試驗中出現(xiàn)的問題，并保留記錄[15]。LC-MS/MS檢測設(shè)備靈敏度和特異度均高于HPLC檢測設(shè)備，運用前景良好，但設(shè)備價格昂貴，對于檢測量不高的項目很多還是需要用到價格相對便宜的HPLC設(shè)備進(jìn)行檢測。實驗室制訂好規(guī)章制度，按要求做好比對試驗，做好詳細(xì)記錄，在性能驗證和比對驗證合格之后，若一臺設(shè)備出現(xiàn)故障維修或需要維修保養(yǎng)期間，可以及時啟用另一臺設(shè)備開展相關(guān)檢測，充分提高設(shè)備檢測利用率，提高檢測時效。兩種方法均可用于日常檢測，但兩者檢測結(jié)果存在差異，如果是需要長期監(jiān)測的患者建議一直選用同一種方法檢測。