王 輝，袁 捷，韓祖成，劉冬玲，陳 杰，RASSUL(哈薩克斯坦)

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021；3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003;4.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046)

心房顫動 (Atrial fibrillation,AF)是一種常見的心律失常,可導致血栓栓塞疾病,引起腦卒中及體循環(huán)栓塞事件[1-2]，危及患者生存質(zhì)量?？鼓委熢诜款澭ㄋㄈ膊≈委熤芯佑谑孜?，目前預防房顫血栓栓塞的口服藥物包括維生素K拮抗劑、抗血小板藥物和 NOAC等[3-5]，雖然這些藥物已經(jīng)在臨床取得顯著療效，但仍存在許多局限性，如治療窗范圍小、個體差異大，受食物、藥物、酒精、年齡和某些疾病等影響大，出血風險高，需要定期采血監(jiān)測INR水平等，抗凝不足或過度，而引發(fā)的血栓栓塞或出血事件是影響抗凝藥物應用的主要原因[6]。體內(nèi)凝血過程的始動和病理性血栓形成的關(guān)鍵是凝血Ⅲ因子，即組織因子(Tissue factor，TF)途徑的啟動，當血管損傷時，在Ca2+的參與下，細胞表面表達的TF與血液內(nèi)的 FⅦ結(jié)合，使FⅦ很快被激活為活性形式FⅦa，形成TF/FⅦa復合物，啟動凝血級聯(lián)反應。組織因子途徑抑制物(Tissue factor pathway inhibitors，TFPI)是TF及其復合物內(nèi)源性抑制因子，TF及其復合物對凝血因子的激活過程受到TFPI的調(diào)控。TF途徑被過度激活和(或)TFPI活性降低均可引起高凝狀態(tài)，從而使機體更易形成血栓；相反，則容易引起出血[7-9]。因此，平衡 TF、TFPI 蛋白表達水平是維持抗凝/出血穩(wěn)態(tài)的重要因素。三七為五加科人參屬，味甘、微苦,性溫,歸肝、胃、心、小腸經(jīng),《本草綱目》最早記載三七具有止血化瘀、消腫止痛等功效[10]。有研究[11-12]表明，三七具有止血、抗心律失常、抗心肌缺血、腦保護、鎮(zhèn)靜止痛、抗炎等作用，在心血管系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)發(fā)揮作用，不僅能發(fā)揮活血作用,而且能夠協(xié)調(diào)發(fā)揮止血作用,三七以其“活血不傷氣、止血不留瘀”雙向調(diào)節(jié)特點在抗凝治療中發(fā)揮優(yōu)勢。本研究從平衡TF、TFPI水平方面，研究三七對AF大鼠眼眥靜脈血液TF、TFPI表達水平、血凝系列、抗凝/出血風險的影響，來探討三七維持抗凝/出血穩(wěn)態(tài)的可能作用機制，為中藥抗凝治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD大鼠24只，250～300 g，雄性，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)質(zhì)量合格證號：SCXK(滬)2018-0004。飼養(yǎng)于25 ℃空調(diào)動物房，相對濕度50%～70%，光暗周期為12 h∶12 h，大鼠可以自由攝食飲水。

1.1.2 實驗藥物及試劑：三七粉，陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉注射液配置為所需濃度的溶液。華法林購自上海信誼九福藥業(yè)有限公司，批號：18190513，臨用前用0.9%氯化鈉注射液配置為所需濃度的溶液。0.9%氯化鈉注射液：安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司，批號：1907202V。羧甲基纖維素鈉：國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20111021。水合氯醛：上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20190823，規(guī)格：250 g/瓶。臨用前用0.9% 氯化鈉注射液配制成濃度為3%的溶液。無水氯化鈣(CaCl2)：西隴科學股份有限公司，批號：1706262。臨用前稱取0.4 g的CaCl2，加0.9% NaCl注射液至20 ml，制成20 mg/ml的溶液，與132 μg/ml的乙酰膽堿溶液等體積混合。乙酰膽堿(ACh)：生工生物工程股份有限公司，批號：F522BA0014，規(guī)格：5 g/瓶。臨用前稱取2.64 mg的ACh，加0.9% 氯化鈉注射液至20 ml，制成132 μg/ml的乙酰膽堿溶液，與20 mg/ml的CaCl2溶液等體積混合。大鼠TF ELISA 試劑盒：48 T/盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；批號：Aug 2020。 大鼠TFPI ELISA 試劑盒：48 T/盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；批號：Oct 2020。

1.1.3 實驗儀器：HW-1000超級恒溫水浴鍋產(chǎn)自成都泰盟科技有限公司。BS 224s型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。BL420生理記錄儀：成都泰盟科技有限公司。Coagu Chek XS(Roche)便攜式血凝儀檢測血凝系列。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備：模型組、三七組、華法林組均建立心房顫動模型[13]。新鮮配置乙酰膽堿-氯化鈣混合液(ACh-CaCl2混合液)，內(nèi)含ACh 99 μg/ml，CaCl210 mg/ml，稱大鼠體重，10%水合氯醛(2.5～3 ml/kg)腹腔麻醉后，將大鼠固定于鼠板，BL420生理記錄儀描記標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖，每日重復尾靜脈注射(1 ml/kg)乙酰膽堿-氯化鈣溶液(含66 μg/ml乙酰膽堿和50 mg/ml氯化鈣)，連續(xù)造模7 d，以制備房顫大鼠模型，心電圖全程記錄，有典型房顫改變(R-R間期不等、P波消失、出現(xiàn)小f波)為造模成功。假手術(shù)組每日尾靜脈注射(1 ml/kg)0.9%氯化鈉溶液，共7 d。模型成功標準:房顫心電圖：R-R間期不等、P波消失、出現(xiàn)小f波。

1.2.2 實驗分組、給藥及取材：24只大鼠適應性喂養(yǎng) 7 d后，隨機分為四組：假手術(shù)組、模型組、三七組、華法林組，每組6 只。假手術(shù)組：灌胃3 ml 0.9%氯化鈉溶液；模型組：灌胃3 ml 0.9%氯化鈉溶液；三七組：造模成功后，給予三七粉0.315 g/(kg·d)溶于 3 ml 0.9%氯化鈉溶液，灌胃；華法林組：造模成功后，給予華法林0.3125 mg/(kg·d)溶于3 ml 0.9%氯化鈉溶液，灌胃；所有灌胃操作均每日 1 次，從造模第1天開始，連續(xù)至第7天。假手術(shù)組、模型組、華法林組大鼠在每個時間點(灌胃后第 3 天、第7天)用 10%水合氯醛(2.5～3 ml/kg)腹腔麻醉后，從眼眥靜脈取血，收集血標本待檢。

1.3 觀察指標

1.3.1 ELISA法檢測大鼠血漿 TF、TFPI水平：將各組大鼠不同時間點血標本以 3.8%枸櫞酸鈉 1∶9 抗凝，3000 r/min 離心10 min，按 ELISA 試劑盒說明書操作分別檢測各組大鼠血漿 TF、TFPI水平。

1.3.2 即時檢測技術(shù)(POCT)檢測大鼠血凝系列：將各組大鼠不同時間點血標本以 3.8%枸櫞酸鈉 1∶9 抗凝，3000 r/min 離心10 min，按Coagu Chek XS(Roche)便攜式血凝儀檢測說明書操作分別檢測各組大鼠國際標準化比值(International normalized ratio,INR)、部分凝血酶時間(Partial thrombin time,PT)。

1.3.3 觀察大鼠皮下出血情況：在房顫模型建立及治療過程中，觀察大鼠有無皮下出血點，并做記錄。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用多樣本方差分析；不同時間點各均數(shù)間的比較行重復測量方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血漿TF水平比較 見表1。治療第3天，與假手術(shù)組比較，其他各組TF值均明顯升高(P<0.05)；華法林組、三七組與模型組TF相比，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而華法林組與三七組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。治療第7天，與假手術(shù)組比較，其他各組TF值均明顯升高(P<0.05)；華法林組、三七組與模型組TF相比，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；華法林組TF水平與三七組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血漿TF水平比較(pg/ml)

2.2 各組大鼠血漿TFPI水平比較 見表2。治療第3天，與假手術(shù)組比較，其他各組TFPI值均明顯升高(P<0.05)；華法林組、三七組與模型組TFPI相比，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而華法林組與三七組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。治療第7天，與假手術(shù)組比較，其他各組TFPI值均明顯升高(P<0.05)；華法林組、三七組與模型組TFPI相比，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；華法林組與三七組相比TFPI水平有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表2 各組大鼠血漿TFPI水平比較(ng/ml)

2.3 各組大鼠INR值比較 見表3。治療第3天，與假手術(shù)組比較，其他各組INR值均明顯降低(P<0.05)；模型組、華法林組和三七組INR值相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；治療第7天，與假手術(shù)組比較，其他各組INR值均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；華法林組、三七組與模型組INR值對比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，華法林組與三七組INR值對比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表3 各組大鼠INR值比較

2.4 各組大鼠PT比較 見表4。治療第3天，與假手術(shù)組比較，其他各組PT均明顯降低(P<0.05)；模型組、華法林組和三七組PT相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；治療第7天，與假手術(shù)組比較，其他各組PT均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；華法林組、三七組與模型組PT對比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，華法林組與三七組PT對比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表4 各組大鼠PT比較(s)

2.5 各組大鼠皮下出血情況比較 假手術(shù)組、模型組、三七組大鼠在建模期間及治療期間均未出現(xiàn)皮下出血情況；華法林組在治療第7天有1只大鼠出現(xiàn)皮下瘀點。

3 討 論

心房纖顫引起的血栓栓塞事件(卒中、體循環(huán)栓塞等)，嚴重影響國民生存質(zhì)量、危害國民健康。目前認為心房顫動血栓形成的機制主要有以下方面:血流動力學紊亂、內(nèi)皮功能異常、血液成分的改變。三者相互作用,共同導致了心房顫動時心房、心耳血栓的形成[14-15]。隨著TFPI的發(fā)現(xiàn)，20世紀90年代所提出的TFP學說，認為TF凝血途徑在血栓形成中發(fā)揮重要作用，使得許多凝血方面問題找到合理解釋。TF是一種含有糖基的單鏈跨膜蛋白,由跨膜區(qū)和膜外區(qū)組成。TF的膜外區(qū)即可溶性TF,是血漿中可測得的TF,與血液的凝固性密切相關(guān)。TF系活化因子Ⅶ的輔因子,對于凝血過程的啟動至關(guān)重要。當因子Ⅶa結(jié)合到TF后,該復合體就通過級聯(lián)效應激活因子Ⅸ和因子Ⅹ而發(fā)揮作用。而該途徑的抑制性調(diào)節(jié)是通過TFPI來完成的,它通過與TF形成穩(wěn)定的四聯(lián)體來阻斷凝血進程。有研究發(fā)現(xiàn),TF和TFPI與血栓栓塞性疾病密切相關(guān)，無論是心房顫動還是腦卒中患者,其血漿TFPI含量均顯著升高,TFPI還是心房顫動預后的獨立因子[16],在血栓栓塞性患者中,血漿TF含量減低,而TFPI含量升高[17]。TF被過度激活和/或TFPI活性降低均可引起高凝狀態(tài)，從而使機體更易形成血栓；相反，則容易引起出血。

中醫(yī)認為，血液滯留或凝結(jié)于體內(nèi)稱為瘀血，包括血溢出于經(jīng)脈外而瘀積，也包括血脈運行受阻而滯留經(jīng)脈腔內(nèi)，既是病理產(chǎn)物，又可成為繼發(fā)性致病因素。AF時血行不暢，留滯于心腔之內(nèi)，形成血栓，即為瘀血。因此，及時清除瘀血、疏通脈道，為治療之首務(wù)。從中醫(yī)“血瘀”理論出發(fā)，“血栓形成的瘀血”應以活血化瘀為治療大法[18]。三七以其暢血脈、散瘀滯、行血不傷新等功效在瘀血治療中廣泛應用?！侗静菥V目》記載三七可以“止血、散瘀、定痛”;《中國醫(yī)藥大辭典》“三七功用補血，去瘀損，止血衄，能通能補，功效最良，是方藥中之最珍貴者”。綜上所述，中藥三七是活血化瘀的代表藥物，活血不傷正氣、止血不留瘀?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，其有效成分三七皂苷、三七素有廣泛藥理作用及臨床用途[19]。舒斌等[20]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，三七素可以縮短大鼠凝血時間，顯著影響大鼠凝血系統(tǒng)而發(fā)揮止血作用。金碩果等[21]通過臨床試驗證實，三七可能通過內(nèi)源性凝血，降低腦卒中患者抗血小板治療中皮膚黏膜出血率。周紅輝等[22]研究表明，三七皂苷具有保護血管內(nèi)皮細胞、抗血小板聚集而發(fā)揮預防血栓形成、抗凝的作用。三七多組分、多靶點、多層次的治療特點是其調(diào)節(jié)促凝與抗凝平衡、且具有雙向調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)。

本研究從平衡TF、TFPI水平方面，研究三七對心房顫動大鼠TF、TFPI表達水平、血凝系列的影響，通過建立房顫大鼠模型，并予以心房顫動大鼠三七治療，對比華法林治療，檢測血液TF、TFPI表達水平以及血凝系列INR，并觀察大鼠皮下出血情況。研究結(jié)果顯示：相比模型組，三七組可以明顯降低房顫大鼠血清TF，而TFPI下降不明顯，提示三七可以間接提高TFPI從而抑制高凝狀態(tài)，預防血栓形成；相比華法林組，三七組可以降低血清TF、TFPI，而華法林組TFPI下降趨勢更明顯，由此推測三七可以通過間接升高TFPI更強力度調(diào)節(jié)血清TF，達到TF、TFPI的相對平衡，以減少出血風險；對于血凝指標INR、PT的影響，治療前3天對比對照組無統(tǒng)計學差異，考慮為三七、華法林起效緩慢，治療初期由于血漿抗凝蛋白細胞被抑制，可以存在短暫高凝狀態(tài)；而治療第7天，三七組和華法林組對于房顫大鼠INR、PT指標均有明顯提高，以抑制高凝狀態(tài)，預防血栓形成，但是華法林對于升高INR趨勢更明顯，考慮觀測時間較短，三七作用還未達到峰值。綜上所述,三七能通過平衡心房顫動大鼠血漿中的TF、TFPI水平,抑制高凝狀態(tài)，減少血栓栓塞并發(fā)癥和防止出血，從而維持抗凝/出血的穩(wěn)態(tài)。

本實驗存在以下不足：①模型方面：尚未觀察三七在持續(xù)性房顫及永久性房顫中對TF、TFPI及血凝系列變化的影響。②觀察周期方面：本實驗觀測時間較短，三七作用還未達到峰值，下一步可以進行多時間點觀測，以進一步明確三七對凝血指標的影響。③三七組分方面：本實驗尚未觀察三七多組分多靶點發(fā)揮效應，下一步可以從三七及其不同組分配伍方面觀察TF、TFPI水平對抗凝/出血穩(wěn)態(tài)的影響。④三七劑量分組方面：本實驗尚未進行劑量分組實驗，下一步可以觀察不同劑量三七對房顫大鼠的影響。