蘭 穎，陳 瑤 ，吳 節(jié)

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072;2.內(nèi)江市第一人民醫(yī)院，四川 內(nèi)江 641099)

卵巢功能障礙是降低女性生育力、引起不孕癥的重要因素之一。促進(jìn)卵泡發(fā)育，獲取成熟卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)的胚胎是體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)成功的前提[1]。臨床證據(jù)已證實針灸能夠通過改善卵巢功能、提高取卵數(shù)量及質(zhì)量、促進(jìn)胚胎著床等多條途徑實現(xiàn)對IVF-ET 臨床妊娠率的積極影響[2-5]。中醫(yī)認(rèn)為女性腎氣盛，天癸至，沖任氣血調(diào)暢是胎孕的基礎(chǔ)。若先天稟賦不足或房事不節(jié)，損傷腎氣、沖任不調(diào)，則不能攝精成孕。故補腎益氣，調(diào)攝沖任是首要原則。因此深入研究針灸在IVF-ET 各環(huán)節(jié)中改善妊娠結(jié)局的作用，對中醫(yī)助孕的前景有著重要的臨床意義。

本研究在促排卵期間，采用B超動態(tài)監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，了解針灸如何影響卵泡動態(tài)發(fā)育和優(yōu)質(zhì)胚胎率。研究結(jié)果將對合理安排針灸干預(yù)啟動時機和療程，優(yōu)化卵母細(xì)胞質(zhì)量、提高優(yōu)質(zhì)胚胎率，最終改善妊娠結(jié)局有著十分重要的參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 受試者來源于2018年3月至2019年12月期間成都附屬醫(yī)院治未病中心門診病例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡21～45歲；②符合2012年美國生殖醫(yī)學(xué)會頒布的女性不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；③符合IVF-ET適應(yīng)癥，配偶身體健康；④明確研究內(nèi)容及風(fēng)險，自愿參加并簽署書面知情同意書。同時滿足上述4項標(biāo)準(zhǔn)，方可納入。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由輸卵管、子宮、免疫或遺傳問題引起的不孕癥患者；②有針灸禁忌、出血傾向、過敏體質(zhì)、酒精或藥物濫用者。符合以上任意一項均予以排除。

通過https://www.medsci.cn/網(wǎng)站隨機化工具產(chǎn)生的隨機數(shù)字，使用順序編號、不透明的信封逐一裝好隨機數(shù)字卡片并封口，受試者按就診順序領(lǐng)取對應(yīng)編號的信封獲得隨機分組信息。三組分別為安神補腎針灸治療組，常規(guī)針灸組以及對照組。本研究方案設(shè)計符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求，由四川省中醫(yī)藥區(qū)域倫理審查委員會審查通過(審查批件號：2018KL-015)。

共納入受試者99例，每組各33例。入組后對照組1例受試者入組后自然妊娠，故未進(jìn)行后續(xù)干預(yù)和數(shù)據(jù)采集。安神補腎針灸組中平均年齡31.30歲;平均病程50.55個月。常規(guī)針灸組平均年齡31.70歲；平均病程51.70個月。對照組平均年齡32.69歲；平均病程50.25個月。各組一般資料如受教育程度、不孕癥類型、不良妊娠次數(shù)、生產(chǎn)次數(shù)、失敗周期數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各項激素指標(biāo)雌二醇(Estradiol,E2)、孕激素(Progesterone,P)、促卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、促黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)、抗繆勒管激素(Anti mullerian hormone,AMH)及竇卵泡計數(shù)(Sinus follicle count,AFC)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組受試者血清激素水平及竇卵泡計數(shù)比較

1.2 治療方法

1.2.1 對照組：僅接受促排卵藥物刺激方案。促排卵：①于前1個月經(jīng)周期的黃體中期(月經(jīng)來潮第21天前后)一次性注射促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a Gonist,GnRH-a)0.4 mg降調(diào)節(jié)；②在下個月經(jīng)周期第3天開始注射促性腺激素 225 IU促排卵，每天1次直至人體絨膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)注射日前1 d；③在月經(jīng)周期第6天給予GnRH-a曲普瑞林，每天1次，每次0.1 mg，持續(xù)至HCG注射日。當(dāng)2～3個主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18 mm、E2水平高于500 pg/ml時，于當(dāng)晚21：00時注射HCG 250 μg，36 h后超聲引導(dǎo)下行陰道穿刺取卵術(shù)。將獲取的卵母細(xì)胞置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)皿中。

體外受精：HCG注射后38～40 h加配偶精子，加精時雙人核對并記錄時間、加精量。30～50 μl的液滴內(nèi)加精5000～10000條，或在1 ml的培養(yǎng)液內(nèi)加精15萬～30萬條。將精卵共培養(yǎng)18～20 h，后觀察受精結(jié)果。

1.2.2 常規(guī)針灸組：在促排卵周期中給予常規(guī)針灸方案。選穴方案：關(guān)元(灸)、氣海、歸來、子宮、腎俞、命門(灸)、三陰交、太溪。穴位定位參考中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會2006年頒布的中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《腧穴名稱與定位》(GB/T12346-2006) 。治療周期自進(jìn)入促排卵周期當(dāng)天開始，直至取卵日前1 d。采用0.35 mm直徑，1～1.5寸毫針針刺，得氣后留針30 min，10 min行針1次，每日治療1次，每個療程連續(xù)5次，療程間間隔2 d。第奇數(shù)次選用正面穴位，受試者取仰臥位，第偶數(shù)次選用背面穴位，取俯臥位。針灸干預(yù)由具有5年以上經(jīng)驗的針灸臨床醫(yī)師實施。

1.2.3 安神補腎針灸組：在促排卵實施的過程中給予安神補腎針灸干預(yù)方案。選穴方案：神庭、合谷、太沖、三陰交、關(guān)元、足三里、神闕(灸)、百會、肝俞、脾俞、腎俞、命門(灸)。施術(shù)方式、療程同常規(guī)針灸組。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 主要結(jié)局指標(biāo)：優(yōu)質(zhì)胚胎率，經(jīng)顯微鏡下觀察胚胎形態(tài)評定。

1.3.2 次要結(jié)局指標(biāo)：經(jīng)陰道彩超動態(tài)檢測進(jìn)周后卵泡發(fā)育情況，記錄進(jìn)周當(dāng)天、進(jìn)周第7天、HCG注射日發(fā)育卵泡個數(shù)、卵泡平均直徑(卵泡最大切面的兩條垂直徑線的平均值)，促排天數(shù)、取卵數(shù)、受精率、兩個原核(2 Pronucleus,2PN)的胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/率及囊胚形成率。

1.3.3 基本病情相關(guān)指標(biāo)：不孕癥類型、不良妊娠次數(shù)、生產(chǎn)次數(shù)、未避孕未孕月數(shù)、FSH、LH、E2、AMH、AFC水平[7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以“中位數(shù)(25%百分位數(shù)，75%百分位數(shù))”表示，采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗。采用雙側(cè)檢驗法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組卵泡發(fā)育情況對比 見表2、3。 各組受試者進(jìn)周當(dāng)天卵泡個數(shù)、卵泡平均直徑、促排天數(shù)均具有可比性的前提下，HCG注射前7 d，兩個針灸組平均卵泡直徑顯著超過對照組(P=0.003)，前兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但以安神補腎針灸組的卵泡直徑增長最快。HCG注射當(dāng)日兩個針灸組平均卵泡直徑分別為18.25(17.81,18.89)mm和18.25(17.45,18.87)mm，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但都顯著高于對照組的17.48(15.93,18.60)mm。在卵泡個數(shù)方面，三組在基線、HCG注射前7 d及HCG注射日三個監(jiān)測時間點的數(shù)據(jù)組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異，但安神補腎針灸組受試者在HCG注射當(dāng)日，直徑大于14 mm的卵泡個數(shù)占優(yōu)，與另外兩組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.020)。說明針灸可以促進(jìn)促排卵期卵泡的發(fā)育，且使卵泡生長的同步性更好。

表2 促排卵期各組卵泡平均直徑與促排天數(shù)比較

表3 促排卵期各組卵泡個數(shù)比較(個)

2.2 各組取卵、受精及優(yōu)質(zhì)胚胎情況比較 見表4。經(jīng)歷相同的促排期后，三組受試者取卵個數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.696)，但受精率以安神補腎針灸組最高，常規(guī)針灸組次之，且與對照組比較存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。2PN胚胎率三組之間基本一致(均P=0.820)。優(yōu)質(zhì)胚胎個數(shù)仍以安神補腎針灸組最高，常規(guī)針灸組次之，與對照組之間兩兩對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但優(yōu)質(zhì)胚胎率的比較中，安神補腎針灸組、常規(guī)針灸組、對照組分別為0.50(0.44,0.60)、0.38(0.25,0.50)、0.33(0.00,0.57)，兩個針灸組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但對照組同兩個針灸組之間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.011)。囊胚形成率組間比較并無統(tǒng)計學(xué)差異。

表4 各組取卵及受精卵發(fā)育情況比較

2.3 不良反應(yīng) 3例輕度不良反應(yīng)事件，均為取針后局部血瘀，其中1例為安神補腎針灸組，2例為對照組，組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.555)。囑受試者當(dāng)日保持血瘀處局部干燥清潔，未行其他處理。

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為女性不孕歸屬“全不產(chǎn)”“無子”“斷緒”等范疇。腎氣盛，天癸至，沖任氣血調(diào)暢是胎孕的基礎(chǔ)。若先天稟賦不足或房事不節(jié)，損傷腎氣、沖任不調(diào)，胞脈失于溫煦，則不能攝精成孕[8]。中醫(yī)治療該病，補腎益氣，調(diào)攝沖任是首要原則[9-10]。本研究通過觀察針灸干預(yù)促排卵期間卵泡的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)針刺能促進(jìn)促排卵期間卵泡的發(fā)育，并提高體外受精率和優(yōu)勢胚胎率，可為胚胎移植奠定堅實的基礎(chǔ)。

首先，結(jié)果發(fā)現(xiàn)促排卵期間針灸干預(yù)對受試者卵泡個數(shù)影響不大，但能促進(jìn)卵泡生長和發(fā)育的同步。目前，臨床最常用的方法既是采用B超測量卵泡大小，卵泡的數(shù)量和生長的同步性是把握促排藥物劑量和注射促性腺激素啟動時機的重要參數(shù)。已有研究證實[11]針刺可有效提高取卵前卵泡膜血流指數(shù)，從而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量、優(yōu)勢胚胎率，結(jié)論與本研究一致。對卵巢功能障礙的不孕人群，針刺不僅能促排卵可改善生殖激素水平，還能促進(jìn)卵泡發(fā)育[12-13]。自然狀態(tài)下的卵泡發(fā)育到18～22 mm是其破裂排卵的時機，但在輔助生殖技術(shù)誘發(fā)的卵泡生長周期中對卵泡大小的監(jiān)測需更加謹(jǐn)慎：當(dāng)單個或一批主導(dǎo)卵泡直徑超過14 mm時，是判斷取消周期或使用拮抗劑的一個重要信號[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在HCG注射日當(dāng)天，安神補腎針灸組受試者平均卵泡直徑最大，且直徑大于14 mm的卵泡個數(shù)最多，說明針灸療法不僅能促進(jìn)卵泡長大，還能優(yōu)化卵泡發(fā)育的同步性。若卵泡直徑相差過大，外源性Gn的啟動可能加大卵泡發(fā)育的不同步，最終降低取卵個數(shù)，因此針灸是提高取卵數(shù)的又一保障。

在取卵和受精情況的比較中，三組的取卵個數(shù)基本持平，但兩個針灸組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于對照組。這種差異與針灸療法及穴位的特異性效應(yīng)相關(guān)。安神補腎組的選穴方案以神庭、四關(guān)、三陰交為主穴，是以中醫(yī)“心腦-腎氣-天癸-沖任-胞宮” 生殖軸的新模式，并認(rèn)為它與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“大腦皮層-下丘腦-垂體-卵巢-子宮生殖” 軸的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)相似[15]。神庭重在調(diào)節(jié)心神與腦神，三陰交平衡肝、脾、腎，四關(guān)重在通達(dá)氣血。三組穴位配合，貫穿心腦、腎氣與陰陽，整體調(diào)節(jié)生殖軸，使精血充足，沖任有養(yǎng)，促進(jìn)卵泡發(fā)育。本次療程是根據(jù)促排卵周期安排的，從促排卵當(dāng)天開始，直至取卵前1 d，針灸治療10～11次，總療程不超過2周。安神補腎針灸組和常規(guī)針灸組之間各結(jié)局指標(biāo)僅存在變化趨勢，并無統(tǒng)計學(xué)差異，考慮為療程不夠。中醫(yī)藥參與IVF-ET的時機應(yīng)該從進(jìn)促排卵周期前開始，改善患者卵巢功能和子宮內(nèi)膜容受性，為胚胎移植打下堅實的基礎(chǔ)[16-17]。通過對針刺改善IVF-ET臨床妊娠率的研究分析，發(fā)現(xiàn)大多干預(yù)周期均在進(jìn)周前1～4個月經(jīng)周期開始，足療程的針灸干預(yù)會提高獲卵數(shù)、受精率、可利用胚胎率，并最終提高臨床妊娠率[18-19]。

本研究在實施過程中，也存在一些局限：①未進(jìn)行中醫(yī)辨證分型，若是肝郁伴腎陽虛的患者，配合安神補腎針灸方案可能在臨床妊娠率上獲效更優(yōu)；② 受設(shè)備的限制，沒能完整監(jiān)測卵泡的長、寬、高，只有三維數(shù)據(jù)才能更好地反映卵泡的形態(tài)變化，甚至可能挖掘出針刺對卵泡形態(tài)學(xué)發(fā)育的修正效果；③未對妊娠率進(jìn)行統(tǒng)計，由于納入受試者取卵后行新鮮胚胎移植和冷凍復(fù)蘇胚胎移植比例組間不均衡，且行凍胚移植的時間距取卵的時間個體間差異較大，并未隨訪到所有受試者的胚胎移植及妊娠情況；④未采集到受試者取卵前激素水平，這些指標(biāo)能在一定程度上幫助評估胚胎著床的成功率[20]。一是并非所有受試者在取卵前都經(jīng)激素水平的監(jiān)測，二是在監(jiān)測了激素水平的受試者采血的時間點根據(jù)其促排卵周期長短的差異不盡相同，因此這部分?jǐn)?shù)據(jù)不完整且不具有時間上的統(tǒng)一性。

為進(jìn)一步驗證針刺效應(yīng)，需根據(jù)不孕癥患者的基本情況和所處的周期，設(shè)計符合針刺即時效應(yīng)、遠(yuǎn)期效應(yīng)特點的干預(yù)方案，并選擇合適的評價指標(biāo)針對IVF-ET各關(guān)鍵階段進(jìn)行動態(tài)結(jié)果追蹤，保證針刺實施的質(zhì)量和刺激量，才能真正體現(xiàn)出針刺助孕效應(yīng)，拓寬針刺助孕的應(yīng)用前景。