李洪超,趙宏博,趙 宏,沈 宇

(1. 佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)又名醋柳果，酸刺果，隸屬胡頹子科沙棘屬，落葉灌木或喬木[1]。沙棘的根、莖、葉、花，特別是果實中含有豐富的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，其維生素C的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鮮棗和獼猴桃，從而被譽(yù)為天然維生素的寶庫[2]。沙棘果多糖是從沙棘果中提取的水溶性多糖。近年來，經(jīng)過我國專家研究，沙棘多糖的藥用價值不斷被發(fā)現(xiàn)，引起越來越多的人對沙棘果進(jìn)行研究探索。

超聲輔助提取法是應(yīng)用超聲波強(qiáng)化提取植物多糖的方法，是一種物理破碎過程[3]。與常規(guī)提取法相比，超聲波提取可縮短提取時間，提高提取率，所以超聲提取在植物多糖的提取中得到廣泛應(yīng)用。本研究選取沙棘果為原材料，采用超聲波輔助法提取沙棘果多糖。采用響應(yīng)面分析法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[4～7]。為沙棘果多糖的研究及應(yīng)用提供一定得理論依據(jù)及實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

哈爾濱裕嘉源農(nóng)業(yè)有限公司提供新鮮的沙棘果，DPPH(美國Sigma公司)，95%乙醇(山東利爾康消毒科技股份有限公司)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，維生素C(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，濃硫酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，苯酚(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，三氯乙酸(上海研生實業(yè)有限公司)。

FA2004N型電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)，757型紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，中空纖維膜(湖州科濾膜技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 沙棘果多糖的提取

準(zhǔn)確稱取沙棘果干粉1000g，按照固液比1:5，加入5000mL石油醚，設(shè)定回流溫度為70℃，回流時間為2h，進(jìn)行石油醚回流脫脂。加入30L蒸餾水，在提取溫度60℃、提取功率100W的條件下進(jìn)行超聲提取45min。將提取液用8層紗布趁熱過濾，濾液進(jìn)行濃縮，冷卻至室溫后，加入95%乙醇，調(diào)乙醇濃度為80%以上，用保鮮膜封口后，置于室溫中醇沉24h。用離心機(jī)3000r/min將醇沉液離心15min，取下層沉淀，置于陰涼處干燥后得沙棘果多糖粗產(chǎn)品。

2.2 沙棘果多糖含量的測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

取濃度為0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別補(bǔ)水至2.0mL，以蒸餾水作為空白對照組，分別加入5%的苯酚1mL，濃硫酸5mL，搖勻，在室溫下靜置10min，置于40℃水浴中保溫15min后冷卻至室溫。用紫外可見分光光度計測定波長在490 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：y=0.8913x+0.0102，R2=0.9994，其中x為多糖質(zhì)量濃度，y為吸光度。

2.2.2 多糖含量的測定

精密稱取干燥多糖樣品10mg，定容至100mL容量瓶中，吸取2mL，按照2.2.1中所述的方法進(jìn)行操作，平行3次實驗取平均值。

多糖含量(%)=

第二，馬克思主義是革命的理論。列寧指出：“馬克思認(rèn)為他的理論的全部價值在于這個理論‘按其本質(zhì)來說，它是批判的和革命的’。后一性質(zhì)的確完全地和無條件地是馬克思主義所固有的，因為這個理論公開認(rèn)為自己的任務(wù)就是揭露現(xiàn)代社會的一切對抗和剝削形式，考察它們的演變，證明它們的暫時性和轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形式的必然性，因而也就幫助無產(chǎn)階級盡可能迅速地、盡可能容易地消滅任何剝削?！盵1]82-83以往的一切所謂“科學(xué)”都在為人剝削人的制度進(jìn)行辯護(hù)，只有馬克思主義對這種人剝削人的制度進(jìn)行了無情的批判，毫不掩飾自己的階級性，公開宣布它就是要代表無產(chǎn)階級利益，為無產(chǎn)階級的革命運(yùn)動服務(wù)。

2.3 沙棘果多糖提取的單因素試驗

取干燥沙棘果實，粉碎，浸泡過夜，按照表1所設(shè)定的條件，分別進(jìn)行單因素試驗考察。

表1 超聲提取法提取條件因素水平

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化多糖的提取工藝

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計對沙棘果總多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化[8～12]。以四因素三水平的響應(yīng)面分析法確定影響沙棘果多糖提取率的水平因素編碼設(shè)計，每個因素選取高、中、低三個水平，共29個試驗點，響應(yīng)面試驗設(shè)計編碼變量見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計編碼變量

3 結(jié)果與分析

3.1 含量的測定結(jié)果

將沙棘果粗多糖在波長490nm處測得吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=0.8913x+0.0102，計算得出沙棘果粗多糖的含量為39%。

3.2 單因素試驗的結(jié)果

3.2.1 料液比對多糖提取率的影響結(jié)果

考察不同料液比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)對多糖提取的影響。由圖1可知，多糖含量隨著料液比的增大先增大后減小，當(dāng)料液比為1:30時，沙棘果多糖的含量最佳，達(dá)34.15%。

3.2.2 提取時間對多糖提取率的影響結(jié)果

考察不同提取時間(15、30、45、60、75min)對多糖含量的影響。由圖1可知，提取率隨著提取時間的增大先增大后減小，當(dāng)提取時間為45min時，沙棘果多糖的提取率最高，達(dá)3.919%；由圖1可知，多糖含量隨著提取時間的增加先增大后減小，當(dāng)提取時間為45min時，沙棘果多糖的含量最佳，達(dá)34.65%。

圖1 料液比、提取時間、提取功率、提取溫度對沙棘果多糖提取含量的影響

考察不同提取功率(60、70、80、90、100W)對多糖含量的影響。由圖1可知，多糖含量隨著提取功率的增大而增大，當(dāng)提取功率為100 W時，沙棘果多糖的含量最佳，達(dá)34.90%。

3.2.4 提取溫度對多糖提取率的影響結(jié)果

考察不同提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對多糖含量的影響。由圖1可知，多糖含量隨著提取溫度的增大先增大后減小，當(dāng)提取溫度為60 °C時，沙棘果多糖的含量最佳，達(dá)33.20%。

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝結(jié)果

3.3.1 試驗條件與試驗結(jié)果

選取料液比、提取時間、提取功率和提取溫度作為影響沙棘果多糖提取率的因素。采用Box-Behnken設(shè)計方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計編碼變量與結(jié)果

圖2 響應(yīng)面結(jié)果

3.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

根據(jù)Design-Expert 軟件采用中心組合試驗Box-Behnken設(shè)計方案繪制響應(yīng)面3D分析圖。由圖2可知，曲線陡峭程度最高且極值點均落在試驗考察去內(nèi)，提取時間與提取功率兩因素對響應(yīng)值影響顯著。

3.4 沙棘果多糖提取工藝的優(yōu)化和驗證

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計方案的計算結(jié)果，確定最佳工藝條件為：提取時間45.29 min，提取溫度61.48℃，提取功率90 W，料液比1:30.88，沙棘果多糖的提取率預(yù)測值為4.023%?？紤]到實際操作的便利，確定沙棘果多糖的提取率的最佳工藝參數(shù)為提取時間46min，提取溫度62℃，提取功率90W，料液比1:31。對響應(yīng)面法優(yōu)化的沙棘果多糖的最佳提取工藝進(jìn)行5次重復(fù)驗證試驗，提取率分別為3.994%、3.996%、3.987%、3.998% 和4.000%。沙棘果多糖的平均提取率為3.995%與模型得出的理論提取率4.023% 接近，表明響應(yīng)面分析優(yōu)化沙棘果多糖的提取工藝條件穩(wěn)定可行。

4 討論

本文采用超聲波輔助法提取沙棘果多糖，在單因素試驗優(yōu)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert軟件，采用Box-Behnken建立沙棘果多糖提取模型。對響應(yīng)面分析法優(yōu)化的沙棘果多糖的最佳提取工藝進(jìn)行5次重復(fù)驗證試驗，平均提取率與理論提取率接近，表明響應(yīng)面分析法穩(wěn)定可行。用響應(yīng)面分析法優(yōu)化沙棘果多糖的提取工藝參數(shù)具有可行性、可靠性，優(yōu)選得到的最佳工藝條件穩(wěn)定。有進(jìn)一步研究和開發(fā)的必要。