金 堃，周 昱，張赫男

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

乳腺癌是乳腺外科常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)2015年乳腺癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤首位。其作為一種復(fù)雜的異質(zhì)性腫瘤，臨床上仍然需要根據(jù)它的病理學(xué)分級(jí)、臨床分期以及分子分型制定因人而異的系統(tǒng)的治療方案[1]。探索乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程仍顯得尤為重要,將為乳腺癌患者提供精準(zhǔn)的臨床診斷和治療[2]。USP9X是最大的泛素特異性蛋白酶家族的一員，文獻(xiàn)報(bào)道USP9X在一些惡性腫瘤中高表達(dá)[3,4]，且表達(dá)程度與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，因其去泛素化作用，可能對(duì)EGFR激活后的正常降解起一定作用，促使EGFR激活后持續(xù)異常表達(dá)。EGFR除了在肺癌、腸癌中表達(dá)外，在部分乳腺癌中也呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)甚至高表達(dá)，在三陰性乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)尤為突出，循證醫(yī)學(xué)Meta分析表明，EGFR影響三陰性乳腺癌的預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)USP9X和EGFR在乳腺癌中的表達(dá)，分析其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義，為乳腺癌的發(fā)生機(jī)制和治療提供一定的借鑒意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科調(diào)取2018-12～2019-07經(jīng)病理學(xué)確診的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和癌旁正常組織蠟塊各50例，性別為女性，排除經(jīng)過(guò)術(shù)前治療的病理資料，患者住院病歷資料均在本院病案室及病理科存檔，并且確認(rèn)臨床病歷資料完整(住院病歷完整，病理標(biāo)本及其免疫組化結(jié)果完整)。

1.2 方法

兔抗人USP9X多克隆抗體購(gòu)于affinity，兔抗人EGFR即用型抗體購(gòu)于北京中杉金橋；與一抗相匹配的二抗、山羊血清、Tween 20、DAB顯色劑 、抗原修復(fù)液、蘇木素染液等；實(shí)驗(yàn)器材及圖文系統(tǒng)等均由本院病理科提供。

標(biāo)本按理想實(shí)驗(yàn)要求切片；60℃烤箱烘烤1h；二甲苯分梯度脫蠟；再用梯度酒精脫去二甲苯；PBS和蒸餾水沖洗；置于EDTA抗原修復(fù)液pH 9.0高溫高壓抗原修復(fù)；切片至Tween 20,浸泡震蕩沖洗去污；切片至于3%的H2O2中滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素，山羊血清抗原封閉；滴加1:25濃度的USP9X一抗、滴加即用型EGFR一抗，常規(guī)孵育；滴加與一抗相匹配的二抗，再次孵育；每一步之間用PBS沖洗3次，每次3min；滴加顯色劑，顯微鏡下控制顯色時(shí)間,用蒸餾水充分沖洗；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核；封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果判定由本院兩位病理科資深醫(yī)師在高倍鏡視野下，進(jìn)行陽(yáng)性結(jié)果判定；最終結(jié)果分為：陽(yáng)性表達(dá)、高表達(dá)和低表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析,r值正數(shù)為正相關(guān)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USP9X在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)

USP9X與EGFR染色定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，在癌組織中高表達(dá)(見(jiàn)圖1A、B),在正常組織中低表達(dá)或者不表達(dá)(見(jiàn)圖1C、D)。在乳腺癌中USP9X和EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與正常組織相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌癌組織及正常組織中USP9X和EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較[n=50,n(%)]

圖1 USP9X和EGFR蛋白的表達(dá)(×400)

2.2 USP9X和EGFR表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

在乳腺癌中，USP9X、EGFR蛋白的表達(dá)與患者的年齡及腫瘤大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EGFR蛋白的表達(dá)與是否為三陰性乳腺癌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 USP9X和EGFR表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

2.3 USP9X與EGFR 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明，在乳腺癌組織中USP9X與EGFR蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.311,P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 乳腺癌組織中USP9X和EGFR表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

眾所周知，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是多基因、多機(jī)制、多步驟、多階段的，連續(xù)過(guò)程。其中周期性作用蛋白及信號(hào)傳導(dǎo)蛋白完成作用后未能正常降解，使得廢棄的蛋白以及應(yīng)該被降解的信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白未被降解，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)以及分裂，因而導(dǎo)致腫瘤的形成。這其中去泛素化的高表達(dá)，作用其底物蛋白，使底物蛋白本身，或者中間途徑的相關(guān)蛋白受到其調(diào)節(jié)，最終未能進(jìn)入泛素—蛋白酶體途徑或者溶酶體途徑被降解，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

人類基因組大約編碼有95個(gè)DUB家族，最大的去泛素化酶家族是泛素特異性蛋白酶家族(USP)。USP9X由N端的核定位序列和蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成，C末端具有催化USP特異性半胱氨酸和組氨酸催化殘基。它屬于USP家族，調(diào)節(jié)參與細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的胞吞胞吐作用、穩(wěn)定性 、細(xì)胞粘附、細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移、自噬、以及細(xì)胞凋亡等。泛素化酶USP9X能通過(guò)活性硫醇位點(diǎn)將泛素與靶蛋白拆分開(kāi)來(lái)[5]。解除和分離底物蛋白上的多聚泛素鍵，防止泛素在底物蛋白聚集，起到去泛素化作用[6]。USP9X表達(dá)的遺傳突變和異常調(diào)節(jié)涉及多種人類疾病，包括神經(jīng)障礙和癌癥 ，例如肝癌和肺癌[7,8]。有研究報(bào)道，USP9X通過(guò)抑制MCL-1泛素化和蛋白酶體降解與MCL-1蛋白相互作用并穩(wěn)定MCL-1蛋白，而USP9X的敲低和化學(xué)抑制均已顯示出有效促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞的增殖，凋亡，耐藥和轉(zhuǎn)都與USP9X緊密相關(guān)[9～11]。到目前為止，已有大約40種蛋白質(zhì)被鑒定為USP9X相互作用蛋白質(zhì)，其中超過(guò)20種蛋白質(zhì)被鑒定為USP9X去泛素化底物。

EGFR是一種存在于人體多種細(xì)胞膜上的糖蛋白，屬于表皮生長(zhǎng)因子家族，又名HER-1。目前在非小細(xì)胞肺癌、頭頸部和宮頸鱗癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了EGFR的表達(dá)。在通常情況下，EGFR以單體的形式存在，當(dāng)其與配體發(fā)生結(jié)合后，將優(yōu)先與HER-2結(jié)合形成異源二聚體，同時(shí)也可以與另一HER-1結(jié)合形成同源二聚體，但是與HER-2結(jié)合形成的異源二聚體功能遠(yuǎn)強(qiáng)于其與HER-1結(jié)合形成的同源二聚體，最關(guān)鍵的是異源二聚體相比較同源二聚體在細(xì)胞膜上停留的時(shí)間較長(zhǎng)，而且不容易被泛素化正常降解，并且發(fā)生再循環(huán)，因而延長(zhǎng)了生長(zhǎng)信號(hào)。當(dāng)配體與受體結(jié)合后即可觸發(fā)內(nèi)吞作用，泛素化連接酶Cbl在觸發(fā)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中起重要作用，有研究報(bào)道最終歸于溶酶體降解途徑[12]。但是，也有研究報(bào)道EGFR與配體相結(jié)合后可以同時(shí)發(fā)生內(nèi)化和泛素化，即也可以同時(shí)通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解。USP9X能夠通過(guò)去泛素化多個(gè)內(nèi)吞E3連接酶來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。E3連接酶Itch通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞蛋白和Cbl(E3連接酶)的蛋白酶體降解來(lái)拮抗活化的EGFR向溶酶體的內(nèi)化和運(yùn)輸[13～15]。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，USP9X和EGFR的表達(dá)水平與乳腺癌的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈正相關(guān)性；兩者不僅各自在一定程度上參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展及預(yù)后，同時(shí)USP9X通過(guò)去泛素化多個(gè)內(nèi)吞E3連接酶促進(jìn)在觸發(fā)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的Cbl在蛋白酶體的降解，最終使EGFR不能通過(guò)溶酶體途徑降解；同時(shí)也推斷USP9X具有直接去泛素化EGFR的作用，使其不被泛素—蛋白酶體途徑降解；最終增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)，延長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)間。結(jié)合研究報(bào)道并且推斷，兩者的高表達(dá)及相關(guān)性有可能是三陰性乳腺癌化療耐藥的潛在機(jī)制。最終得出結(jié)論：USP9X和EGFR與乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展、治療及預(yù)后相關(guān)，為乳腺癌的研究提供新的方向。