王 晶,曲修勝,馬雪梅,李樹民,楊曉東,李 娜

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院呼吸內科，黑龍江 佳木斯 154003)

原發(fā)性支氣管肺癌簡稱肺癌，是我國病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康，依據(jù)GLOBOCAN估算，2012 年全球患有癌癥人數(shù)可達1410 萬人，因其死亡人數(shù)達820 萬，其中肺癌是最常見的腫瘤之一[1]，因此更早的期診斷、治療肺癌有著非常重要的意義。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)Th22 細胞是一種的新型、獨立的 CD4+輔助性T細胞亞群，IL-22是其分泌的重要細胞因子，在腫瘤疾病中，已經有研究表明Th22細胞及其分泌的IL-22因子在肝癌、胃癌等均有表達[2]，在胰腺癌中，IL-22也可以通過STAT3通路加強胰腺癌細胞生長[3]。而IL-9是于2008年被研究發(fā)現(xiàn)主要由Th9分泌的擁有促炎作用的CD4細胞亞群，通過激活STAT3磷酸化也能促進人胰腺癌生長[4]，因此二者可能在腫瘤疾病中存在某種聯(lián)系，但對于Th22、IL-22與IL-9在肺癌中的關系鮮有報道，因此本研究擬探討Th22細胞、IL-22與IL-9在肺癌發(fā)病中的表達情況及相關性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

肺癌組選取2018-11～2019-05在我院確診的肺癌患者35例作為實驗組；年齡42～78歲，平均65歲，男21例，女14例，所有病例均經病理組織學檢測確定為肺癌，健康對照組35 例，為同期于我院體檢的健康者，其中男25例，女10例，年齡40～82歲，平均70歲。納入標準：1)年齡>18歲；2)已確診并明確病理及組織分型的原發(fā)性肺癌患者；3)既往未接受過放化療治療，并且未應用免疫抑制劑治療的患者。實驗排除標準：1)有肺結核、肺部急性感染等其他肺部疾病的肺癌患者；2)有嚴重心、肝、腎功能有異常的患者；3)有其他惡性腫瘤史的癌癥患者；所收集的實驗組35例患者研究資料收集經研究對象知情同意，遵守倫理學的各項規(guī)定。

1.2 實驗方法1.2.1 主要儀器及試劑

美國BD公司流式細胞儀、芬蘭(Labsystems Multiskan MS)公司352型酶標儀、中國海爾4℃和-20℃冰箱，-80℃超低溫冰箱，北京索萊寶科技有限公司人外周淋巴細胞分離液、BD PharMingen、anti-CD4-APC試劑、Biolegend、anti-IL-22-PE，及相應同型對照抗體，莫能霉素及破膜劑均來自美國BD公司，ELISA 檢測試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2.2 方法

1.2.2.1 血液標本的采集: 用肝素抗凝采血管采集入組病人的靜脈血4mL,用非抗凝普通采血管采集靜脈血1mL, 冰盒保存并于1h內轉移至實驗中心待用，待血液凝固后，將1mL全血2500rpm 4℃離心10min，取上清液分裝于 EP 管中，每管 50μL，保存于-80℃低溫冰箱。

1.2.2.2 Th22細胞的檢測: 將經過肝素鈉作抗凝處理的新鮮采集的外周4mL全血標本取出，混勻，加入PBS液8mL,進行稀釋；小心提取外周血單個核細胞后，將上述液體孵育4h后取出孵育板，使用移液器將收集培養(yǎng)箱中細胞，盡量全部吸出，分別轉移到2個流式管中，標記為對照管和檢測管，加入PBS吹打混勻，1200rpm×5min洗滌1遍后棄上清；分別吸取熒光標記的表面抗體，anti-CD4-APC-H7加入檢測管中，對照管中加入相應同型對照抗體，充分混勻，靜置30min；2mL PBS洗滌一次，200μL的4%多聚甲醛重懸，室溫靜置20min后，兩管中分別加入1mL破膜劑，震蕩混勻，避光孵育后，分別再向兩管中加PBS 5mL,離心5min棄上清，RPMI1640重懸；向檢測管加入細胞內細胞因子抗體 anti-IL-22-PE；并向對照管中加入同型對照抗體，充分混勻后，4℃條件下避光孵育30min；PBS5mL洗滌后重懸，將重懸后的細胞液體采用 BD FACSCantoⅡ流式細胞儀上機檢測 ，結果以CD4+IL-22+T細胞在CD4+T細胞中所占百分比進行統(tǒng)計。

1.2.2.3 IL-22、IL-9的檢測： 將待測標本及ELISA試劑盒預先從冰箱拿出，并拆除密封袋，核對好所需實驗試劑，嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 試劑盒操作步驟檢測血清中IL-22、IL-9 表達水平，測出OD值繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 Th22細胞的表達水平

肺癌患者與健康對照組外周血中，Th22細胞(CD4+IL-22+T)、IL-22、IL-9因子的表達水平見表1；可以看出，實驗組Th22、IL-22的表達水平明顯高于對照組(P<0.01)，差異有顯著性；實驗組IL-9表達水平高于對照組(P<0.05)，差異有顯著性。見圖1～2。

表1 肺癌患者與健康人群Th22細胞、IL-22、IL-9因子的表達水平

圖1 肺癌組與對照組Th22表達水平

圖2 肺癌組與對照組IL-22、IL-9的表達水平

2.2 相關性分析

肺癌患者中，Th22、IL-9與IL-22表達相關性分析見圖3～4； 經Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，肺癌實驗組患者外周血中，Th22、IL-22呈正相關(r=0.605，P<0.01),IL-22與IL-9呈正相關(r=0.58,P<0.05)。

圖3 Th22與IL-22相關性分析

圖4 IL-22與IL-9相關性分析

3 討論

肺癌是世界范圍內因腫瘤疾病死亡主要原因之一，臨床上在治療無效的原因多是轉移和耐藥，較早的發(fā)現(xiàn)腫瘤，是治療腫瘤疾病重要的一個環(huán)節(jié)[5]。體液免疫和細胞免疫組成了機體的免疫系統(tǒng)，而細胞免疫在抗腫瘤中發(fā)揮重要作用，在細胞免疫中起主要作用的效應細胞是 CD4+T淋巴細胞[6]。 Duhen T等人在2009年發(fā)現(xiàn)Th22細胞是一種新型 Th 細胞， 并提出高分泌IL-22細胞因子，因此對于二者的研究越來越多[7]，Th22細胞及效應因子IL-22因子存在很多疾病中，在炎癥性疾病中，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡中、系統(tǒng)性硬化癥、白塞病中，二者均高表達[8]，另外還參與了表皮免疫和修復，在腫瘤系統(tǒng)疾病中， Curd[9]等實驗提出，IL-22在人胰腺癌中能夠引起STAT-3磷酸化，這表示IL-22在人胰腺癌細胞中促進腫瘤生長。在乳腺癌中， 實驗組Th22細胞、IL-22因子表達高于對照組[10]。IL-9是機體重要免疫因子之一，有研究證實，其能夠參與惡性腫瘤疾病的發(fā)生，在肝癌患者中，IL-9能夠使肝癌細胞增殖，并且在肝癌腹水中表達增強[11]，在胰腺癌裸鼠移植瘤研究中，IL-9能夠通過激活 STAT3磷酸化促進其生長，并且縮短裸鼠的生存壽命[12]。但對于Th22、IL-22與IL-9在肺癌患者外周血的表達及相關性鮮有報道。

本研究結果提示，肺癌患者外周血中，Th22細胞與IL-22因子表達較健康對照組升高，由圖3也可以看出二者呈正相關，更加說明IL-22由Th22分泌，Th22通過介導分泌IL-22參與肺腫瘤的發(fā)生發(fā)展。IL-9在實驗組中的表達明顯高于健康對照組，IL-22因子與IL-9二者呈正相關，可能與二者促進STAT-3通路加快肺腫瘤的生長有關，這表明Th22細胞、IL-22因子與IL-9在肺腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，可能促進人類肺腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展，具體機制可能與其能夠促進STAT3磷酸化有關，STAT3是雙功能蛋白，主要是能通過酪氨酸磷酸化通路發(fā)揮作用，在人腫瘤疾病中表達升高[13]。 在肺腫瘤疾病中的作用，需要進一步研究?？梢酝ㄟ^調節(jié)Th22 細胞及IL-22、IL-9因子表達，從而調節(jié)機體免疫狀態(tài)，為肺腫瘤疾病的防治策略提供依據(jù)。