于云祥 龔泰芳 劉小濤 柯文 李彬彬 廉凱 徐進(jìn)△

骨肉瘤是常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，惡性程度高，預(yù)后差，5年生存率低[1]。近年分子靶向治療成為腫瘤治療研究熱點(diǎn)。盡管骨肉瘤治療方法已不斷更新，但是治療效果卻不甚理想，尋找有效的治療方法具有重要的意義。SOX7是含高遷移率組蛋白(HMG)結(jié)構(gòu)域的SOX基因家族SOXF亞組成員之一，在癌癥中低表達(dá)，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用[2-4]。有研究表明miR-664能通過(guò)靶向抑制SOX7增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[5]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是比較經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，如下調(diào)RIPK4可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖[6]。但SOX7與骨肉瘤細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)及其可能相關(guān)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系還未明確。鑒于此，本研究通過(guò)建立重組體pcDNA3.1-SOX7，旨在探討過(guò)表達(dá)SOX7對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、周期、凋亡、免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達(dá)及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma；FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco；pcDNA3.1載體及Lipofectamine 2000試劑盒均購(gòu)自Invitrogen 公司；SOX7、β-catenin、cyclinD1、survivin、VEGF和TGF-β1抗體及HRP標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)CST；細(xì)胞凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD；酶標(biāo)儀及凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素及10% FBS)，在5%CO2、37 ℃恒溫、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。每2～3 d換液1次，依據(jù)細(xì)胞密度傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h調(diào)整MG-63細(xì)胞密度，以2 mL/孔(5×105/mL)接種于6孔板。分為重組pcDNA3.1-SOX7組、pcDNA3.1組和空白組。無(wú)雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63細(xì)胞24 h，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)90%～95%的細(xì)胞密度。無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗6孔板內(nèi)細(xì)胞兩遍，加2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基分別稀釋pcDNA3.1-SOX7、pcDNA3.1及Lipofectamine 2000，輕搖混勻。將稀釋好的pcDNA3.1-SOX7和pcDNA3.1分別與Lipofectamine 2000混合，室溫孵育20 min，加入6孔板相應(yīng)的孔內(nèi)，在5%CO2、37 ℃恒溫、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換為含血清的完全培養(yǎng)基。48 h后通過(guò)Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3Western Blot檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOX7和pcDNA3.1 48 h的MG-63細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，在冰上反應(yīng)30 min，離心，收集上清。BCA試劑盒測(cè)定上清蛋白濃度。蛋白與上樣緩沖液混勻，煮沸變性5 min。取40 μg變性蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE、半干法轉(zhuǎn)NC膜及5%脫脂奶粉封閉膜后，洗膜，加稀釋后的SOX7、β-catenin、CyclinD1、Survivin、VEGF和TGF-β1抗體(稀釋比例1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，加1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37 ℃搖床震蕩1 h，洗膜，ECL顯色。Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的MG-63細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板，參照前述方法轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOX7和pcDNA3.1，并設(shè)置空白組，在培養(yǎng)的24，48和72 h收集上述3組細(xì)胞，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，450 nm吸光度酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值(A)。以A值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率 按照前述方法轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOX7后48 h，收集細(xì)胞，將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞，常規(guī)固定處理，PI染色，篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布。同樣方法收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書染色，避光室溫放置15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-SOX7轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞效率

pcDNA3.1-SOX7轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞48 h，通過(guò)Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果如圖1和表1所示，轉(zhuǎn)染重組體pcDNA3.1-SOX7后，MG-63細(xì)胞SOX7表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體組SOX7表達(dá)與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 pcDNA3.1-SOX7轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后SOX7的蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖1 pcDNA3.1-SOX7轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后SOX7蛋白表達(dá)

2.2 過(guò)表達(dá)SOX7抑制MG-63細(xì)胞活力

如表2所示，pcDNA3.1-SOX7轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞24，48和72 h，細(xì)胞活力均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而pcDNA3.1組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOX7的MG-63細(xì)胞活力

2.3 過(guò)表達(dá)SOX7阻滯MG-63細(xì)胞周期

如表3所示，與空白組比較，pcDNA3.1-SOX7組G0/G1期細(xì)胞百分比升高，G2/M期和S期細(xì)胞百分比降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不同組間、不同時(shí)間點(diǎn)間、組間×?xí)r間交互作用下的過(guò)表達(dá)SOX7阻滯MG-63細(xì)胞周期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。

表3 過(guò)表達(dá)SOX7對(duì)MG-63細(xì)胞周期的影響

2.4 過(guò)表達(dá)SOX7誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡

如圖2和表4所示，pcDNA3.1-SOX7轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞48 h，細(xì)胞凋亡率明顯高于空白組(P<0.05)。

圖2 過(guò)表達(dá)SOX7對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響

表4 過(guò)表達(dá)SOX7后的各組MG-63細(xì)胞凋亡率

2.5 過(guò)表達(dá)SOX7抑制MG-63細(xì)胞VEGF和TGF-β1表達(dá)

通過(guò)Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOX7的MG-63細(xì)胞免疫抑制相關(guān)因子VEGF和TGF-β1表達(dá)，結(jié)果如圖3和表5所示，pcDNA3.1-SOX7組VEGF和TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯低于空白組(P<0.05)。

表5 過(guò)表達(dá)SOX7的MG-63細(xì)胞VEGF和TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖3 過(guò)表達(dá)SOX7對(duì)MG-63細(xì)胞VEGF和TGF-β1表達(dá)的影響

2.6 過(guò)表達(dá)SOX7抑制MG-63細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路

通過(guò)Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOX7的MG-63細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、CyclinD1和Survivin表達(dá)，結(jié)果如圖4和表6所示，pcDNA3.1-SOX7組β-catenin、CyclinD1和Survivin蛋白表達(dá)均明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 過(guò)表達(dá)SOX7對(duì)MG-63細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

表6 過(guò)表達(dá)SOX7的MG-63細(xì)胞β-catenin、CyclinD1和Survivin的蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

SOX7是SOX基因家族SOXF亞組成員之一，近年來(lái)的研究表明SOX7在結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)，其表達(dá)降低可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[7-9]，這提示在腫瘤發(fā)生發(fā)展中SOX7可能充當(dāng)抑癌基因樣作用。骨肉瘤中關(guān)于SOX7的研究較少，有研究顯示SOX7是miR-664的一個(gè)靶基因，miR-664可通過(guò)靶向抑制SOX7增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[5]。SOX7是否可影響骨肉瘤細(xì)胞凋亡、周期等生物學(xué)特性還未明確。本研究結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SOX7的人骨肉瘤MG-63細(xì)胞SOX7表達(dá)明顯升高，細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，細(xì)胞凋亡率明顯升高，提示SOX7同樣可影響骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，可能是骨肉瘤診療的一個(gè)分子標(biāo)記。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt信號(hào)的經(jīng)典信號(hào)途徑，人類多種腫瘤可發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常表達(dá)，如肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等[10-13]。多項(xiàng)研究表明SOX7可通過(guò)調(diào)控膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤Wnt/β-catenin信號(hào)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[14-15]。已有研究證實(shí)SOX7是Wnt/β-catenin/TCF信號(hào)的抑制因子，可通過(guò)與TCF競(jìng)爭(zhēng)與β-catenin結(jié)合，從而發(fā)揮腫瘤抑制基因功能[6]。SOX7對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響是否與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)還未明確。本研究將過(guò)表達(dá)SOX7載體轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞，通過(guò)Western Blot檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin及下游與腫瘤發(fā)生密切相對(duì)的靶基因cyclinD1和Survivin表達(dá)，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SOX7可明顯下調(diào)β-catenin、cyclinD1和Survivin表達(dá)，提示SOX7對(duì)骨肉瘤細(xì)胞活力、周期及凋亡影響機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，這也與前人在其他腫瘤中的研究結(jié)果一致。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是一種多功能的蛋白多肽，是目前已發(fā)現(xiàn)的腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的最強(qiáng)的免疫抑制因子，TGF-β1過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞侵襲能力更強(qiáng)，且預(yù)后不良[16-17]。已有研究表明TGF-β1可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[18]，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)可由大多數(shù)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)腫瘤血管生成有促進(jìn)作用。多種腫瘤中VEGF呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)與患者預(yù)后不良及無(wú)瘤生存期密切相關(guān)[19]。有研究表明抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可明顯降低VEGF表達(dá)[20]，SOX7是否可影響TGF-β1和VEGF表達(dá)還未明確。本研究結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SOX7可明顯下調(diào)TGF-β1和VEGF表達(dá)，提示SOX7抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制之一可能是降低免疫逃逸。

綜上所述，本研究將過(guò)表達(dá)SOX7的載體轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG-63細(xì)胞，通過(guò)CCK-8法、流式細(xì)胞儀、Western Blot分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)SOX7后的MG-63細(xì)胞活力、周期、凋亡及免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達(dá)及Wnt/β-catenin信號(hào)通路β-catenin、cyclinD1和Survivin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SOX7可明顯抑制MG-63細(xì)胞活力，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)TGF-β1和VEGF及Wnt/β-catenin信號(hào)通路β-catenin、cyclinD1和Survivin表達(dá)，提示SOX7可能是骨肉瘤分子診療靶點(diǎn)之一，但目前SOX7對(duì)骨肉瘤的影響及其機(jī)制研究較少，還需進(jìn)一步深入研究。