吳波文 蔡偉良 劉歡歡 劉銀 李潔 朱寶玉 曾偉△

假體周圍感染(Prosthetic Joint Infections，PJI)是全關(guān)節(jié)置換術(shù)中最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]，因其難以診斷導(dǎo)致2年發(fā)病率達1%～2%[2-3]。因此，須尋找更敏感的PJI早期診斷指標(biāo)。紅細胞沉降率(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive Protein，CRP)和白細胞數(shù)(White Blood Cell Count，WBC)已用于PJI診斷，但這些血清指標(biāo)的檢測尚缺乏敏感性和特異性。D-二聚體是體內(nèi)嚴(yán)重感染的關(guān)鍵指標(biāo)[4-6]，與PJI的關(guān)系尚不清楚。因此本研究建立PJI兔模型，監(jiān)測D-二聚體的表達變化，明確其在PJI早期診斷中的價值。

1 實驗動物與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus，MSSA)購買于美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，目錄號35521)，并在本實驗室保存。無特定病原(Specified Pathogen Free，SPF)級新西蘭大白兔(成年，雄性，體質(zhì)量(5.84±0.91)kg)購于湖南省實驗動物中心。CRP、ESR、WBC試劑盒以及D-二聚體檢測ELISA試劑盒均購于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 動物模型和分組

本研究的動物實驗方案已由本院倫理委員會審批通過(審批號2020031107)，依照當(dāng)前人初次人工髖關(guān)節(jié)置換多為生物型，通過3D打印技術(shù)制作兔生物型解剖型人工股骨頭。構(gòu)建假體周圍感染動物模型：將注射生理鹽水(MSSA含量為0)作為對照設(shè)為MSSA-A組，將MSSA分別以0.5×104，0.5×105，0.5×106cfu/mL濃度1 mL菌液注入關(guān)節(jié)腔，分別按順序設(shè)為MSSA-B、MSSA-C、MSSA-D組，各10只。圍手術(shù)期不用抗生素，術(shù)后兔分籠喂養(yǎng)，肢體不制動，隨意活動。術(shù)后2周處死動物。選取體型大小基本一致日本大白兔40只，隨機抽選3只完成計算機化X射線體層照相術(shù)(Computerized Tomography，CT)三維重建，通過計算機設(shè)計，3D打印人工股骨頭，制作生物型解剖型人工股骨頭及髓腔銼等手術(shù)工具；人工股骨頭仿當(dāng)前臨床常用假體，將鈷-鉻-鉬合金的燒結(jié)多孔涂層燒結(jié)于鈦合金假體上。

細菌培養(yǎng)：分別取MSSA菌株接種于血瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑選單個菌落用無菌0.9%氯化鈉溶液2 mL將菌落洗脫并搖勻，用細菌濃度比濁儀配成0.5×106cfu/mL濃度的MSSA懸濁液。再根據(jù)實驗要求細菌濃度，將其部分稀釋并準(zhǔn)備成0.5×105cfu/mL和0.5×104cfu/mL濃度分裝備用。

構(gòu)建動物模型：20 g/L戊巴比妥鈉溶液30 mg/kg兔耳緣靜脈麻醉，以左側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子為中心，做長4 cm 的弧形切口，從左股前與外側(cè)肌間隙進入髖關(guān)節(jié)，切除股骨頭保留股骨距2 mm。以自制髓腔銼擴髓，插入假體，輕敲致假體固定牢固，保持20°～30°的前傾角，連續(xù)鎖邊縫合關(guān)節(jié)囊，再間斷縫合關(guān)閉手術(shù)切口。為避免淺層軟組織醫(yī)源性感染，嚴(yán)密縫合關(guān)節(jié)囊及深部肌層后即用無菌針頭將菌液注入關(guān)節(jié)囊(見圖1)。

圖1 手術(shù)過程大體圖片

1.3 觀察指標(biāo)

首先進行大體觀察：術(shù)后觀察切口愈合情況，有無紅、腫和生物膜形成。其次，在術(shù)前及術(shù)后1，7，13 d取各組白兔耳緣靜脈抽取血液標(biāo)本，記錄WBC、CRP、ESR及D-二聚體數(shù)值。所有指標(biāo)均嚴(yán)格按照生產(chǎn)商提供的說明書進行檢測。

術(shù)后2周靜脈注射苯巴比妥100 mg/kg對兔子實施安樂死。參照肌肉骨骼感染協(xié)會MSIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，假體周圍感染的診斷需要滿足至少一個主要指標(biāo)(形成與假體相通的竇道或在兩份獨立的關(guān)節(jié)腔液標(biāo)本中檢測到致病菌)，本研究選取兩塊假體周圍組織，如細菌培養(yǎng)均與接種菌相符，考慮假體周圍感染兔模型構(gòu)建成功。

使用無菌技術(shù)從手術(shù)部位收取植入的螺釘和墊圈，將墊圈用5 mL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗5次，獲取假體周圍菌液原樣本。對菌液進行涂板培養(yǎng)：培養(yǎng)18～24 h，通過菌落形態(tài)、涂片鏡檢進行確認，隨后進行細菌計數(shù)。細菌陽性率=(接種菌的數(shù)量/總細菌的數(shù)量)×100%。

1.4 生物膜的電鏡觀察

13 d后靜脈注射苯巴比妥100 mg/kg對兔子實施安樂死。使用無菌技術(shù)從手術(shù)部位收取植入的螺釘和墊圈。將墊圈用5 mL磷酸鹽緩沖鹽水沖洗5次，在固定劑(2.5%戊二醛)中保存24 h[7]。脫水并涂上金-鈀后，隨機選擇一個觀察區(qū)域并標(biāo)記在墊圈上。然后，用掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)(日本東京JEOL有限公司)分析墊圈。由于螺釘形狀不規(guī)則，因此無法通過SEM掃描。所有參與微生物實驗和SEM研究的人員都不知道樣品的類型和分組。

1.5 檢測指標(biāo)

比較MSSA-B、MSSA-C、MSSA-D之間菌液濃度和假體周圍細菌陽性率。各組對比D-二聚體表達差異，明確D-二聚體在不同時間及不同細菌濃度所致假體周圍感染中敏感性及特異性有無差異。分析D-二聚體與細菌感染的不同濃度的相關(guān)性及D-二聚體與感染時間的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 假體周圍感染兔模型的建立及評估

術(shù)后1周觀察兔子的行為，模型組兔子明顯出現(xiàn)右后肢體和左側(cè)不協(xié)調(diào)，兔子拒絕觸地，可明顯觀察到切口出現(xiàn)紅腫等炎癥特征，本實驗中所有兔均無死亡。術(shù)前及術(shù)后1，7，13 d取各組白兔耳緣靜脈抽取血液標(biāo)本進行檢測，統(tǒng)計CRP、ESR、WBC及D-二聚體的濃度(見表1-4)。

表1 各組白兔耳緣靜脈抽取血液CRP含量

術(shù)后2周安樂死處死兔子，并從MSSA-B組、MSSA-C組、MSSA-D組的關(guān)節(jié)腔液標(biāo)本中檢測到金黃色葡萄球菌，與接種菌類型一致。另外，從MSSA-B組、MSSA-C組、MSSA-D組的關(guān)節(jié)腔液標(biāo)本中檢測到金黃色葡萄球菌，與接種菌也一致。以上結(jié)果表明假體周圍感染兔模型構(gòu)建成功(見圖2)。

表2 各組白兔耳緣靜脈抽取血液

表3 各組白兔耳緣靜脈抽取血液D-二聚體的相對水平

表4 各組白兔傷口處WBC含量

2.2 感染后13 d葡萄球菌生物膜的形成

評估MSSA感染后13 d后假體關(guān)節(jié)生物膜形成的變化。用掃描電鏡直接觀察隨機選取區(qū)域的假體生物膜的形成情況(見圖2)，除MSSA-B組外，MSSA-C組和MSSA-D組可見生物膜大量形成，三組均可見密集的細菌堆積。

圖2 掃描電子顯微鏡觀察植入假體表面生物膜及附著葡萄球菌的圖像(箭頭指示生物膜，×1 000)

2.3 不同濃度細菌對假體周圍細菌陽性率的影響

各組(B、C、D組)之間不同菌液濃度的假體周圍細菌陽性率有差異(F=214.366，P=6.125×10-5)。與MSSA-B組(25.24±3.61)比，MSSA-C組(31.41±1.92)和MSSA-D組(51.36±2.88)的細菌陽性率明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.251，9.998；P=0.014，0.005)。另外，與MSSA-C組比，MSSA-D組的假體周圍細菌陽性率增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.552，P=0.023)。

2.4 D-二聚體的動態(tài)表達與感染時間的相關(guān)性

分析各組的D-二聚體的表達與感染時間的相關(guān)性(見表5)，D-二聚體和感染時間之間無相關(guān)性(P=0.588，0.247，0.099，0.062)。

表5 各組的D-二聚體水平與感染時間的相關(guān)性

2.5 D-二聚體的動態(tài)表達與細菌濃度的相關(guān)性

分析各組的D-二聚體的表達與細胞感染濃度的相關(guān)性(見表6)，在1，7，13 d時間點，D-二聚體和細菌濃度均正相關(guān)(P=0.003，0.002，0.001；r=0.921，0.955，0.923)。

表6 術(shù)后1 d D-二聚體水平與細菌濃度的相關(guān)性

3 討論

目前在臨床實踐中仍缺乏廣泛采用的有效PJI診斷方法。以往研究主要集中于炎癥標(biāo)志物，而最近研究發(fā)現(xiàn)凝血級聯(lián)反應(yīng)的啟動是PJI的常見早期事件，參與該過程的許多相關(guān)分子也是炎癥反應(yīng)的重要放大因子[8]。血液中D-二聚體是一種重要的凝血生物標(biāo)志物，具有鑒定PJI的疑似病例或排除非PJI病例的潛在作用。

D-二聚體已用于監(jiān)測與全關(guān)節(jié)置換術(shù)發(fā)生后深靜脈血栓形成和失血有關(guān)的纖溶活性波動[9-10]。同時，D-二聚體本身充當(dāng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑和增強劑，并有助于感染性生物或炎癥細胞的定位[11-12]。一項前瞻性隊列研究共招募684名敗血癥患者，并觀察到更高水平的D-二聚體與死亡率增加相關(guān)，該研究突顯D-二聚體在敗血癥患者中的預(yù)后意義[13]。Xie等[14]的研究顯示血漿D-二聚體水平在初次PJI后6 h達到峰值，維持升高24 h，并持續(xù)90 d恢復(fù)到術(shù)前水平。Parvizi等[15]提出了假體周圍關(guān)節(jié)感染的新定義，并列出了三種循環(huán)標(biāo)志物(CRP，D-二聚體和ESR)作為術(shù)前診斷的次要標(biāo)準(zhǔn)。與之前的研究一致，本研究觀察到PJI葡萄球菌感染兔模型中D-二聚體明顯升高，而且還進一步觀察到與D-二聚體感染細菌濃度正相關(guān)。但是同樣觀察到CRP和ESR水平也隨著感染細菌的濃度增加而持續(xù)增加，表明PJI的診斷可能同時需要血液D-二聚體、CRP、ESR水平的共同指示。

另外，血液中D-二聚體的診斷價值受到最近發(fā)表的幾項研究的質(zhì)疑，這些研究認為對原發(fā)性或持續(xù)性PJI的診斷僅具有中等敏感性和特異性[16-17]。有薈萃分析的研究總結(jié)表明，單個特異性D-二聚體測試的陽性結(jié)果仍不能診斷PJI。對于D-二聚體作為PJI的診斷生物標(biāo)志物的價值判斷，應(yīng)保持保守的態(tài)度[18]。CRP和ESR都是急性期的指標(biāo)，也是廣泛建立的PJI血清標(biāo)志物[16-17，19-20]。CRP，D-二聚體和纖維蛋白原的常規(guī)檢測具有成本效益，CRP檢測的價格約為ESR的兩倍[21-23]。根據(jù)最新的薈萃分析結(jié)果[18]和本研究的結(jié)果，筆者推測D-二聚體結(jié)合ESR或D-二聚體結(jié)合CRP在診斷PJI中可能具有較好的應(yīng)用前景。

由于大多數(shù)與假體相關(guān)的感染是由表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和MSSA引起的[24]，聚乙烯對表皮葡萄球菌極具吸引力，但是假體金屬更適合MSSA的黏附[25]。因此，PJI治愈率的差異與多種復(fù)雜因素有關(guān)。浮游細菌附著在植入物上產(chǎn)生的生物膜使PJI的治療更加困難，原因是生物膜可以抵抗宿主的細胞和體液免疫反應(yīng)，而且對抗菌劑的敏感性低。另外，生物膜內(nèi)的細菌生存時間更長，并成為細菌的來源，這些細菌擴散到植入物表面的其他部位，可以形成新的生物膜。本研究觀察到中濃度和高濃度在13 d時已經(jīng)有較多的生物膜形成，此時D-二聚體已經(jīng)持續(xù)增加，但是無論高濃度或低濃度MSSA感染1 d即發(fā)現(xiàn)D-二聚體和細菌數(shù)量明顯增加但是此時還未觀察到生物膜形成。因此，D-二聚體的濃度變化對PJI的早期診斷有價值。

本研究中提出的動物模型復(fù)制了關(guān)節(jié)假體中常用的生物材料的關(guān)節(jié)內(nèi)植入，但存在如下缺陷：首先，該動物模型與人類假體關(guān)節(jié)置換的力學(xué)模式不同。其次，這種動物模型適用于PJI中血液和其他指標(biāo)的變化，但不適用于其他人工關(guān)節(jié)研究，例如關(guān)節(jié)假體松動。因此，仍需要開發(fā)更接近人類假體的人工關(guān)節(jié)動物模型。另外，需要進一步分析在不同菌種感染的假體模型中D-二聚體的變化與細菌感染的相關(guān)性，以確定D-二聚體是否可以作為最敏感的診斷標(biāo)志物。

綜上所述，金黃色葡萄球菌感染假體植入兔模型中可形成生物膜，而且D-二聚體與金黃色葡萄球菌濃度正相關(guān)，因此D-二聚體可作為一種極為敏感金黃色葡萄球菌的變化指標(biāo)，與CRP及ESR指標(biāo)有相當(dāng)?shù)脑\斷效能。