張雨曦* 莊倩 李玉倩 石林 章卓 姜鮮

（1. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2019 級研究生，四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，四川瀘州 646000；3. 瀘州市人民醫(yī)院麻醉科，四川 瀘州 646000）

心血管疾病是目前病死率較高的疾病[1]，發(fā)病機(jī)制與心肌細(xì)胞損傷有關(guān)，其中心肌細(xì)胞的氧化損傷是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，可大大增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]。近年來研究顯示，氧化損傷可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和生理功能受損，進(jìn)一步誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，并最終演變成心力衰竭[3]。因此，減輕心肌細(xì)胞的氧化損傷對緩解心血管疾病尤為重要。

紅參提取物（Red ginseng extract，Rge）包含人參皂苷類、有機(jī)酸類、糖類等多種活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)心功能等多種藥理作用，尤其在免疫系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病中具有明顯的抗氧化作用[4-10]。但是，目前采用細(xì)胞模型對Rge 減輕心肌氧化損傷的研究較少，因此本研究旨在研究Rge 減輕過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）致H9c2 心肌細(xì)胞氧化損傷的作用及相關(guān)機(jī)制，并為Rge 防治心肌氧化損傷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

大鼠心肌細(xì)胞（H9c2）株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用含10% FBS 和1%青-鏈霉素的DMEM/H 培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每兩天進(jìn)行換液和傳代。

1.1.2 藥物與試劑

紅參提取物（含量大于98%，西安維珍生物科技有限公司，中國）；過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）（上海麥克林生化科技有限公司，中國）；DMEM/H 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；FBS（Gibco，美國）；青-鏈霉素溶液（北京羅比生物科技有限公司，中國）；MTT（北京索萊寶科技有限公司， 中國）； 乳酸脫氫酶（ Lactate dehydrogenase，LDH）（南京建成生物工程研究所，中國）；Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin 抗體（Proteintech，美國）；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；PAGE快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，中國）；雙敏化學(xué)發(fā)光試劑（Affinity，美國）；蛋白Marker（北京索萊寶科技有限公司，中國）；5× SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，JC-1 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法篩選H2O2最優(yōu)造模濃度

選對數(shù)生長期的H9c2 心肌細(xì)胞（7×103個(gè)·孔-1）接種于96 孔板中，設(shè)置對照組和模型組，每組6 個(gè)復(fù)孔，貼壁24 h 后給藥。對照組常規(guī)培養(yǎng)；模型組用不同濃度（0.9 mg·kg-1、1.8 mg·kg-1、3.6 mg·kg-1、7.2 mg·kg-1、14.4 mg·kg-1）H2O2溶液處理6 h 后，棄上清，以含10% MTT 的培養(yǎng)液孵育4 h 后，每孔換用DMSO 100 μL，搖床震蕩5 min，測定490 nm 波長處吸光度值（OD）。細(xì)胞存活率=模型組OD /對照組OD×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2 Rge 對H9c2 心肌細(xì)胞增殖的影響

選對數(shù)生長期的H9c2 心肌細(xì)胞（7×103個(gè)·孔-1）接種于96 孔板中，設(shè)置對照組和Rge 組，每組6 個(gè)復(fù)孔，貼壁24 h 后給藥。對照組常規(guī)培養(yǎng)；Rge 組用不同濃度（50、100、200、400、800、1600 mg·kg-1）Rge 溶液培養(yǎng)24、48、72 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟參照1.2.1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 Rge 對H2O2致H9c2 心肌細(xì)胞氧化損傷的作用

對數(shù)生長期H9c2 心肌細(xì)胞（7×103個(gè)·孔-1）接種于96 孔板中，設(shè)置對照組，模型組，Rge 低、中、高濃度組，每組6 個(gè)復(fù)孔，貼壁24 h 后給藥。對照組常規(guī)培養(yǎng)；模型組用9 mg·kg-1的H2O2溶液處理6 h；Rge 低、中、高濃度組分別用200 mg·kg-1、400 mg·kg-1和800 mg·kg-1Rge 溶液處理24 h 后，9 mg·kg-1H2O2溶液繼續(xù)處理6 h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟參照1.2.1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 化學(xué)法檢測LDH 釋放量

選對數(shù)生長期的H9c2 心肌細(xì)胞（1×104個(gè)·孔-1）接種于24 孔板中，細(xì)胞按1.2.3 進(jìn)行分組和給藥，每組3 個(gè)復(fù)孔。，吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清于1.5 mL EP 管，4℃條件下，以3000 g 離心10 min。結(jié)束后，取上清液，按試劑盒說明書檢測。

1.2.5 JC-1 法凋亡染色

選對數(shù)生長期的H9c2 心肌細(xì)胞（5×104個(gè)·孔-1）接種于6 孔板中，設(shè)置對照組，模型組，CCCP 組（陽性對照），Rge 低、中、高濃度組，每組3 個(gè)復(fù)孔，貼壁24h 后給藥。對照組常規(guī)培養(yǎng)；模型組和CCCP 組分別用9 mg·kg-1的H2O2溶液和2.05 mg·kg-1的CCCP 溶液處理6 h；Rge 低、中、高濃度組分別用200 mg·kg-1、400 mg·kg-1和800 mg·kg-1的Rge 溶液處理24 h 后，9 mg·kg-1的H2O2溶液繼續(xù)處理6 h。處理完畢后，PBS 清洗兩次，JC-1 染色工作液與完全培養(yǎng)基1：1 混合，37 ℃作用20 min 后，除去上清，用1×JC-1 緩沖液清洗兩次，最后加入2 mL PBS，熒光顯微鏡下觀察染色情況并進(jìn)行拍照。

1.2.6 Western blot 法檢測細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)

選對數(shù)生長期的H9c2 心肌細(xì)胞（5×105個(gè)·孔-1）接種于6 孔板中，細(xì)胞按1.2.3 進(jìn)行分組和給藥，每組3 個(gè)復(fù)孔。用預(yù)冷的PBS 洗三次，每孔以80μL 裂解液（PMSF：PⅠPA=1：100）裂解細(xì)胞，置于冰上0.5h；4℃條件下，以12000 g 離心10 min；結(jié)束后，回收上清，BCA 試劑盒測定各組細(xì)胞蛋白濃度；將各組蛋白樣品與5×上樣緩沖液按1：4 混合后，金屬?。?5℃）煮蛋白10 min；PAGE凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白；濕法轉(zhuǎn)膜；用封閉液室溫封閉40 min；TBST 溶液快速洗膜3 次，每次10 min；結(jié)束后，分別加入Caspase-3、Bax、Bcl-2 抗體在4 ℃孵育過夜；次日再用TBST 溶液快速洗膜3 次，每次10 min；然后加入二抗，室溫?fù)u床慢速孵育1 h；TBST 溶液洗膜3 次，每次10 min；最后加入顯影液，用凝膠成像儀采集圖像。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±SD）表示，組間的差異以單因素方差分析進(jìn)行比較。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rge 對H2O2 損傷的H9c2 心肌細(xì)胞活力的影響

利用MTT 法測定H2O2致H9c2 心肌細(xì)胞氧化損傷的ⅠC50，見圖1A，與對照組相比，模型組的細(xì)胞活力呈現(xiàn)劑量依賴性降低（P＜0.05 或P＜0.001），其ⅠC50為9.16 mg·kg-1，故后續(xù)試驗(yàn)選擇9 mg·kg-1H2O2作為H9c2 心肌細(xì)胞氧化損傷的造模濃度。同時(shí)，利用MTT 法檢測不同濃度Rge與H9c2 心肌細(xì)胞作用24、48、72 h 的影響，見圖1B，與對照組相比，50、100、200、400、800 mg·kg-1Rge 作用H9c2 心肌細(xì)胞24、48、72 h 時(shí)，細(xì)胞的活力沒有任何影響（P＞0.05），然而Rge 濃度為1600 mg·kg-1時(shí)，細(xì)胞的活力顯著被抑制（P＜0.001），故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用200、400、800 mg·kg-1Rge 分別作為低、中和高濃度用于預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞24 h。

圖1 MTT 法評價(jià)Rge 和H2O2 對細(xì)胞活力的影響

最后，利用MTT 法評價(jià)Rge 對抗H2O2所致的氧化損傷，見圖1C，與對照組相比，模型組的細(xì)胞活力降至50.09%（P＜0.05），表明成功建立氧化損傷模型，與模型組相比，Rge 低、中、高濃度組的細(xì)胞活力分別提升了9.21%、25.34% 和36.25%，表明Rge 呈劑量依賴性降低H2O2所致的氧化損傷。

2.2 Rge 對H2O2 誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞LDH 的影響

如圖2 所示，對照組LDH 釋放量為13.45%，模型組中LDH 釋放量升高至70.12%，Rge 低、中、高濃度組的LDH 釋放量分別為61.81%、46.12%和23.18%。與模型組相比，Rge 低、中、高濃度組LDH 的釋放量呈現(xiàn)劑量依賴性降低，表明Rge能夠抑制LDH 的釋放量抵抗H2O2造成的氧化應(yīng)激損害從而減輕細(xì)胞膜的破壞。

圖2 Rge 對H2O2 誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞LDH 的影響

2.3 Rge 對H2O2 誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，模型組和CCCP 組產(chǎn)生明顯綠色熒光，紅色熒光相對減弱，表明成功建立H9c2 心肌細(xì)胞氧化損傷模型。與模型組和CCCP組相比，Rge 低、中、高濃度組綠色熒光呈劑量依賴性降低，表明Rge 可以控制線粒體膜電位的下降，抑制H9c2 心肌細(xì)胞的凋亡，見圖3。

圖3 JC-1 法評價(jià)Rge 對H2O2 誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞凋亡的影響（×200）

另外，Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組中Caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯增加，達(dá)到2.2 倍（P＜0.01）；與模型組相比，Rge 低、中、高濃度組中Caspase-3 和Bax蛋白表達(dá)水平隨著Rge濃度增加依次降低了51.29%、78.26%、78.75% 和24.41%、34.13%、79.47%，而Bcl-2 蛋白表達(dá)水平依次增加了12.97%、24.46%和24.59%，詳細(xì)見圖4。

圖4 Western blot 法評價(jià)Rge 對H2O2 誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白的表達(dá)

3 討論

氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)心肌細(xì)胞損傷的主要病理機(jī)制之一[11]。若機(jī)體長期處于氧化損傷狀態(tài)會(huì)造成心肌組織細(xì)胞大量死亡，從而引發(fā)心力衰竭等嚴(yán)重疾病。H2O2能參與體內(nèi)較多重要的胞內(nèi)反應(yīng)，如轉(zhuǎn)錄因子的激活，但是當(dāng)H2O2在細(xì)胞內(nèi)聚集過多時(shí)，則加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成心肌細(xì)胞凋亡，為了盡可能的重現(xiàn)臨床上氧化損傷心肌病變的進(jìn)程，我們利用H2O2構(gòu)建體外氧化損傷模型[12-14]。在評價(jià)Rge 對H9c2 心肌細(xì)胞活力影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Rge 能以劑量依賴性的方式提高H9c2 心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力，從而抵抗H2O2導(dǎo)致的氧化損傷。LDH 釋放量可是評價(jià)細(xì)胞活力和細(xì)胞膜完整性的關(guān)鍵指標(biāo)[15,16]。處于氧化損傷狀態(tài)的心肌細(xì)胞，其細(xì)胞膜完整性受損，導(dǎo)致LDH 大量釋放，使細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重。我們發(fā)現(xiàn)Rge能夠抑制LDH 的釋放，表明Rge 能夠保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，減輕細(xì)胞損傷。過激的氧化損傷可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17,18]。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞處于凋亡早期的標(biāo)志之一。JC-1 試劑盒能通過熒光顏色的改變判斷線粒體膜電位的變化，從而衡量細(xì)胞凋亡的狀態(tài)。Rge 低、中、高濃度組線粒體基質(zhì)內(nèi)的紅色熒光隨著Rge濃度的增加而逐漸明亮，并且胞質(zhì)內(nèi)的綠色熒光逐漸消失，因此，Rge 能抑制線粒體膜電位的下降，減輕H9c2 心肌細(xì)胞的氧化損傷，阻斷H9c2心肌細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是H9c2 心肌細(xì)胞氧化損傷的重要過程，研究Rge 對凋亡的影響可反應(yīng)Rge 保護(hù)心肌細(xì)胞氧化損傷的部分機(jī)制。Caspase-3 是凋亡中重要的樞紐蛋白，能和Bax 分別啟動(dòng)和調(diào)控細(xì)胞的凋亡，但該過程可被調(diào)控凋亡途徑的抗凋亡蛋白Bcl-2 阻斷[19,20]。我們發(fā)現(xiàn)，Rge能下調(diào)Caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)。因此，Rge 可能通過阻斷凋亡途徑，增強(qiáng)H9c2 心肌細(xì)胞對氧化損害的抵抗作用。

綜上，Rge 可能通過促進(jìn)Bcl-2 蛋白表達(dá)并且阻斷Caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)，從而減輕H2O2致H9c2 心肌細(xì)胞的氧化損害，從而增強(qiáng)H9c2 心肌細(xì)胞抵抗不利因素的能力，但是否與其他作用機(jī)制有關(guān)待需進(jìn)一步研究。