閆咨儒 林娟 李娥瓊

宮頸癌是女性癌癥中死亡率第二位的癌癥，具有較高的發(fā)病率，尋找新的治療靶標(biāo)和預(yù)后生物標(biāo)志物以提高宮頸癌患者的存活率非常迫切[1]。研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在在宮頸癌的預(yù)后及各種生物學(xué)過程中都起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，可作為宮頸癌診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物以及宮頸癌未來靶向治療的靶點(diǎn)[2]。長鏈非編碼叉頭蛋白F1-反義RNA1(lncRNA FOXF1-AS1)也稱為FENDRR，有報(bào)道lncRNA FOXF1-AS1在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與胃癌患者浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為患者預(yù)后判斷的參考指標(biāo)[3]。FOXF1-AS1在肺癌中顯著下調(diào)表達(dá)，F(xiàn)OXF1-AS1穩(wěn)定過表達(dá)通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[4]。然而FOXF1-AS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及其機(jī)制尚不清楚。microRNA參與調(diào)控宮頸癌的進(jìn)展[5]，有報(bào)道m(xù)iR-146b-3p下調(diào)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，遷移和錨定非依賴性生長[6]。circ_0000520通過海綿化miR-146b-3p抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，侵襲和遷移，同時(shí)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡[7]。而FOXF1-AS1是否通過調(diào)控miR-146b-3p影響宮頸癌的進(jìn)展尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究FOXF1-AS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及其機(jī)制是否與miR-146b-3p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 宮頸癌組織和癌旁組織來源 宮頸癌組織和癌旁組織取自我院2017年5月至2019年12月確診的35例宮頸癌患者，經(jīng)手術(shù)切除癌組織，患者手術(shù)前未進(jìn)行過手術(shù)及放化療，患者均知情且同意。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 宮頸癌細(xì)胞SiHa購自上海滬崢生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；MTT試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自日本同仁研究所；RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物科技公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞處理與分組 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞SiHa，取對(duì)數(shù)生長期SiHa，將pcDNA、pcDNA-FOXF1-AS1轉(zhuǎn)染至SiHa中，記為pcDNA組、pcDNA-FOXF1-AS1組；將pcDNA-FOXF1-AS1分別與miR-NC、miR-146b-3p轉(zhuǎn)染至SiHa中，記為pcDNA-FOXF1-AS1+miR-NC組、pcDNA-FOXF1-AS1+miR-146b-3p組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測FOXF1-AS1和miR-146b-3p表達(dá)水平 提取組織和細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按試劑盒說明進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系：2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl無菌水；反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。FOXF1-AS1和miR-146b-3p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，F(xiàn)OXF1-AS1上游引物序列：5’-TTCATCGGCTGCGTATTCG-3’，下游引物序列：5’-TTGCCTTCTAGTCGCCTCC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游引物序列：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；miR-146b-3p上游引物序列：5’-TGAGAACTGAATTCCATAGGCT-3’，下游引物序列：5’-GCACTGTCAGACCGAGACAAG-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物序列：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。

1.5 MTT檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)至48 h，每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150 μl DMSO，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成數(shù) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制成1×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以每孔100個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)2周出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，PBS漂洗后用結(jié)合緩沖液重懸，加后入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻，避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜，加入稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，ECL顯色，暗室下X線膠片顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測FOXF1-AS1和miR-146b-3p的靶向關(guān)系 構(gòu)建FOXF1-AS1的野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-FOXF1-AS1和MUT-FOXF1-AS1，其分別與miR-NC和miR-146b-3p共轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞中；按照說明書檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 FOXF1-AS1在宮頸癌中的表達(dá) 與癌旁組織相比，宮頸癌組織中FOXF1-AS1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2 過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa增殖的影響 與pcDNA組相比，pcDNA-FOXF1-AS1組FOXF1-AS1表達(dá)水平升高，miR-146b-3p表達(dá)水平降低，細(xì)胞OD值降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)減少(P<0.05)。見表2。

表2 過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa增殖的影響

2.3 過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa凋亡的影響 與pcDNA組相比，pcDNA-FOXF1-AS1組細(xì)胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高，pro-caspase3表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa凋亡及caspase3蛋白表達(dá)的影響(A 過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa凋亡的影響；B 過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)caspase3蛋白表達(dá)的影響)

表3 過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa凋亡的影響

2.4 FOXF1-AS1靶向miR-146b-3p Starbase預(yù)測顯示FOXF1-AS1與miR-146b-3p具有結(jié)合位點(diǎn)；與miR-NC組相比，miR-146b-3p轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-FOXF1-AS1的細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。見圖2，表4。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖2 FOXF1-AS1靶向miR-146b-3p

2.5 miR-146b-3p能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa增殖凋亡的影響 與pcDNA-FOXF1-AS1+miR-NC組相比，pcDNA-FOXF1-AS1+miR-146b-3p組細(xì)胞OD值升高，克隆形成數(shù)增多，細(xì)胞凋亡率降低，Cleaved-caspase3表達(dá)水平降低，pro-caspase3表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 miR-146b-3p能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa凋亡及caspase3蛋白表達(dá)的影響(A miR-146b-3p能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa凋亡的影響;B miR-146b-3p能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)caspase3蛋白表達(dá)的影響)

表5 miR-146b-3p能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa增殖凋亡的影響

3 討論

目前宮頸癌治療方式主要還是以手術(shù)為主，放化療為輔；腫瘤精準(zhǔn)治療的提出表明了靶向性，精準(zhǔn)化個(gè)性靶向治療是今后宮頸癌臨床治療的大方向[8,9]。研究表明lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中占重要作用，F(xiàn)OXF1-AS1在肺腺癌中表達(dá)降低，其表達(dá)與單獨(dú)的總體生存相關(guān)，是一種新的潛在診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物[10]。FOXF1-AS1在非小細(xì)胞肺癌中作為腫瘤抑制因子起作用[11]。而有研究報(bào)道FOXF1-AS1在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)，沉默F(xiàn)OXF1-AS1通過降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)在體內(nèi)外顯著抑制細(xì)胞增殖，遷移，侵襲和腫瘤生長[12]。以上研究表明FOXF1-AS1在不同腫瘤中可能起不同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，宮頸癌組織中FOXF1-AS1表達(dá)水平顯著低于癌旁組織；過表達(dá)FOXF1-AS1后，SiHa細(xì)胞中miR-146b-3p表達(dá)水平降低，細(xì)胞OD值降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3表達(dá)水平升高，pro-caspase3表達(dá)水平降低；表明過表達(dá)FOXF1-AS1可能抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

有研究表明下調(diào)miR-146b-3p可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，遷移[6]。且研究報(bào)道m(xù)iR-146b-3p在非小細(xì)胞肺癌患者外周循環(huán)血中呈顯著過表達(dá)，可用作早期非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)志物[13]。circ_0071662通過使miR-146b-3p變海綿抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲[14]。miR-146b-3p在甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，增強(qiáng)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXF1-AS1可靶向調(diào)控miR-146b-3p，且miR-146b-3p可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FOXF1-AS1對(duì)SiHa增殖、凋亡的影響。提示，F(xiàn)OXF1-AS1可能通過調(diào)控miR-146b-3p表達(dá)抑制SiHa增殖，促進(jìn)SiHa凋亡。

綜上所述，過表達(dá)FOXF1-AS1可能通過下調(diào)miR-146b-3p抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。