楊三虎 何偉

食管癌(esophageal cancer，EC)為臨床常見消化道腫瘤，多發(fā)于40歲以上人群，典型的癥狀為進行性咽下困難，嚴重影響患者生命健康及生活質(zhì)量[1,2]。手術(shù)為治療EC最重要的方法，尤其是以胸腔鏡為代表的微創(chuàng)手術(shù)，較傳統(tǒng)手術(shù)具有更高有效性及安全性，臨床應(yīng)用廣泛[3]。國內(nèi)外均有報道指出，EC惡性生物學(xué)行為如腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度等，是腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素[4,5]。研究指出，EC患者ALC1基因表達升高，可增強癌細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致EC總生存率下降[6]。微小RNA-1299(miR-1299)被證實在EC組織中的表達水平降低，可能與癌細胞的遷移和侵襲能力相關(guān)[7]。此外，V型膠原蛋白α2鏈(COL5-A2)被認為是食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因，與患者預(yù)后密切相關(guān)[8]?；诖?，本研究嘗試探究ALC1、miRNA-1299、COL5-A2與EC惡性生物學(xué)行為的關(guān)系及預(yù)測胸腹腔鏡外科手術(shù)后復(fù)發(fā)的效能，旨在為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月至2019年6月西安軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腹腔鏡外科手術(shù)治療后1年內(nèi)復(fù)發(fā)的EC患者45例，作為研究組，其中男25例，女20例；年齡49～78歲，平均年齡(64.25±6.86)歲。另選取胸腹腔鏡外科手術(shù)治療后1年內(nèi)未復(fù)發(fā)的EC患者45例，作為對照組，其中男28例，女17例；年齡47～79歲，平均年齡(63.58±7.7)歲。2組一般資料具有均衡性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①EC的診斷及復(fù)發(fā)診斷均參照相關(guān)標準[9]，并經(jīng)病理診斷確診；②符合EC手術(shù)指征[10]；③無神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心理障礙；④臨床資料完整；⑤患者知曉本研究，已簽署同意書。

1.2.2 排除標準：①血液系統(tǒng)疾病患者；②合并其他惡性腫瘤者；③嚴重心腦血管疾病患者；④免疫性疾病、感染性疾病患者；⑤肝腎等臟器功能嚴重障礙者。

1.3 方法

1.3.1 EC組織指標檢測方法：2組術(shù)后均留取EC組織，并于入組當天取活檢組織，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測各組織中ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表達水平，具體操作如下：稱取待檢組織100 mg，置于EP試管中，加入1 ml裂解液后充分研磨，隨后于低溫下提取總RNA，核酸測定儀測定RNA含量，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行擴增，條件為95℃ 5 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環(huán)，ALC1引物上游序列為：5’-GGTGGAGTTGGCATGA

ACTT-3’，下游序列為：5’-CACTCAACTGGAGGTCAG

CA-3’；miR-1299引物上游序列為：5’-TAAAGGTATG

GAGCGATGTGA-3’，下游序列為：5’-GGGTAGCGAA

AGGTGTAGAAG-3’；COL5 A2引物上游序列為：5’-AGGAACAGAAGTGCGAGGAGG-3’，下游序列為：5’-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGATG-3’；上下游引物均購自廣州銳博生物科技有限公司，采用2-ΔΔCt法計算ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表達水平。

1.3.2 血清惡性生物學(xué)行為指標檢測方法：包括血清半乳凝素-9(galectin-9，Gal-9)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、半乳糖凝集素-3(galectin-3)，采集患者術(shù)前空腹靜脈血3 ml，以3 500 r/min轉(zhuǎn)速、8 cm半徑離心處理5 min，取血清置于-70℃冷藏室保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測上述指標水平，試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，檢測操作由專業(yè)人員嚴格按照試劑盒說明書完成。

1.4 觀察指標 (1)2組一般資料及血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平，一般資料包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(Body mass index，BMI)、吸煙、病理分型史、腫瘤位置、合并癥。(2)2組術(shù)后、入組時EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表達情況。(3)探究術(shù)后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA與血清惡性生物學(xué)指標的相關(guān)性。(4)術(shù)后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2高表達與低表達者病理特征，包括年齡、性別、BMI、吸煙、病理分型史、腫瘤位置、合并癥、腫瘤分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度，腫瘤分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度均于術(shù)前參照相關(guān)指南[11]進行評估。(5)探究術(shù)后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2表達水平與惡性生物學(xué)行為的關(guān)系，及預(yù)測EC術(shù)后復(fù)發(fā)的效能。

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料、血清惡性生物學(xué)行為指標比較 2組患者年齡、性別比、BMI、吸煙、病理分型史、腫瘤位置、合并癥比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；研究組患者血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組一般資料、血清惡性生物學(xué)行為指標比較 n=45,例(%)

2.2 2組EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA比較 研究組術(shù)后、入組時EC組織ALC1、COL5-A2 mRNA均較對照組高，miR-1299 mRNA較對照組低(P<0.05)。免疫組織化學(xué)法檢測顯示，研究組術(shù)后、入組時EC組織ALC1、COL5-A2呈強陽性表達，miR-1299呈弱陽性表達；對照組術(shù)后、入組時EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2呈弱陽性表達，miR-1299呈強陽性表達。見表2。

表2 2組EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA相對表達量比較

2.3 ALC1、miR-1299、COL5-A2高表達與低表達者病理特征比較 以術(shù)后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2平均值作為分界點，分為高表達、低表達患者。高表達與低表達患者的年齡、性別、BMI、吸煙、病理分型史、腫瘤位置、合并癥差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高表達與低表達患者的腫瘤分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 ALC1、miR-1299、COL5-A2高表達與低表達者病理特征比較 例(%)

2.4 ALC1、miR-1299、COL5-A2表達與血清惡性生物

學(xué)行為指標的相關(guān)性 Spearman相關(guān)系數(shù)模型分析相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)術(shù)后EC組織ALC1、COL5-A2表達與血清Gal-9、VEGF、Galectin-3間正相關(guān)，miR-1299與血清Gal-9、VEGF、Galectin-3間呈負相關(guān)(P<0.05)。見圖1～3。

圖1 ALC1與血清惡性生物學(xué)行為指標的相關(guān)性

2.5 ALC1、miR-1299、COL5-A2與惡性生物學(xué)行為的關(guān)系 Spearman相關(guān)系數(shù)模型分析相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)術(shù)后EC組織ALC1、COL5-A2表達水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度間存在正相關(guān)關(guān)系，miR-1299表達水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度間存在負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見表4。

圖2 COL5-A2與血清惡性生物學(xué)行為指標的相關(guān)性

圖3 miR-1299與血清惡性生物學(xué)行為指標的相關(guān)性

表4 ALC1、miR-1299、COL5-A2表達水平與惡性生物學(xué)行為的相關(guān)性分析

2.6 ALC1、miR-1299、COL5-A2預(yù)測復(fù)發(fā)的效能 繪制術(shù)后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2聯(lián)合預(yù)測EC術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線，顯示各指標聯(lián)合預(yù)測的AUC最大，為0.872，最佳預(yù)測敏感度、特異度分別為86.67%、80.00%(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 ALC1、miR-1299、COL5-A2預(yù)測復(fù)發(fā)的效能

圖4 ALC1、miR-1299、COL5-A2預(yù)測復(fù)發(fā)的ROC

3 討論

調(diào)查顯示，2018年全球36種癌癥中，EC的發(fā)病率和死亡率分別居第7位和第6位[12]。盡管近年來EC的診斷技術(shù)和多學(xué)科治療取得明顯進展，但EC患者的5年生存率仍然低于20%[13,14]。腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致預(yù)后不佳的主要因素，積極探索相關(guān)特異性生物標志物，對控制腫瘤進展、延長患者生存期具有重要意義[15,16]。

近年來，基因診斷與基因治療在惡性腫瘤中的作用越來越受臨床重視。ALC1為肝癌的最新候選癌基因，是從人體肝癌細胞的染色體1q21區(qū)分離并克隆的一個新基因，具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能，也是SNF-2類家族中具有致癌作用的基因[17,18]。但其在EC發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)中的作用鮮有研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，EC組織中ALC1基因表達水平明顯升高，胸腹腔鏡外科手術(shù)后其表達水平呈降低趨勢，但EC術(shù)后復(fù)發(fā)患者的EC組織中ALC1基因表達水平高于未復(fù)發(fā)患者，提示ALC1基因表達可能與EC的發(fā)生發(fā)展及術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，可能與其調(diào)控下游基因及促進細胞增殖相關(guān)。ALC1基因具有上調(diào)Cdk2及細胞周期蛋白CyclinE、下調(diào)蛋白p53及其下游效應(yīng)基因p21表達的作用，能加速細胞G1期到S期的進程，且能促進DNA合成，從而促進腫瘤細胞增殖，導(dǎo)致腫瘤進展、復(fù)發(fā)[19]。

miR是一類高度保守的非編碼RNA，越來越多的證據(jù)指出miR在癌癥的基因表達調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20,21]。有報道指出miR-1299可通過負向調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路，抑制癌細胞的遷移、侵襲[22]。本研究還發(fā)現(xiàn)，EC組織中miR-1299表達水平明顯降低，手術(shù)治療后其表達水平有升高，但術(shù)后復(fù)發(fā)患者的EC組織中miR-1299表達水平仍明顯偏低，可能與EC發(fā)生發(fā)展、術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，COL5-A2基因在EC組織中的表達明顯升高，且術(shù)后復(fù)發(fā)患者高于未復(fù)發(fā)患者。COL5-A2是膠原家族的重要成員，被認為與癌癥發(fā)生有關(guān)，已有研究證實其在舌鱗狀細胞癌、膀胱癌組織中的表達均升高，可促進癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移[23]。但其在EC中的具體作用機制尚未明確，仍有待進一步探究。

本研究分析其與EC患者血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清Gal-9、VEGF、Galectin-3與術(shù)后EC組織ALC1、COL5-A2表達呈正相關(guān)，與miR-1299表達呈負相關(guān)。Gal-9可誘導(dǎo)巨噬細胞、T細胞、胸腺細胞等多種類型細胞的凋亡，與腫瘤的凋亡、轉(zhuǎn)移等機制密切相關(guān)[24,25]。VEGF為腫瘤血管生成的主要推動因子，可促進腫瘤內(nèi)新血管形成，為腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移提供動力[26]。Galectin-3具有調(diào)節(jié)細胞生長、黏附、分化及凋亡的作用，可促進食管癌新血管生成及腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移[27]。由此可見，ALC1、miR-1299、COL5-A2與EC惡性生物學(xué)行為有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度與術(shù)后EC組織ALC1、COL5-A2呈正相關(guān)，與miR-1299呈負相關(guān)，進一步證實了ALC1、miR-1299、COL5-A2與EC惡性生物學(xué)行為均存在密切相關(guān)性?；谏鲜鲅芯浚覀兪状尾捎肦OC曲線探究ALC1、miR-1299、COL5-A2預(yù)測EC術(shù)后復(fù)發(fā)的效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各指標預(yù)測EC術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC均>0.7，具有良好預(yù)測價值，尤其是各指標聯(lián)合預(yù)測的AUC高達0.872，可為臨床預(yù)測患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險提供更準確信息。

綜上所述，EC組織中ALC1、miR-1299、COL5-A2基因表達異常，與EC惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，且各指標聯(lián)合在預(yù)測患者術(shù)后復(fù)發(fā)方面具有良好效能，具有較高臨床應(yīng)用價值。