李飛揚 俞杭

胃癌是一組病因尚不明確的消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤疾病，好發(fā)于>50歲的人群，男性較女性常見，國外男女胃癌的發(fā)病比例接近2∶1，而我國胃癌男性患者遠較女性患者多，其比例為(3～4)∶1[1]。由此可知，隨著醫(yī)學的進步，胃癌并沒有遠離我們的生活，反而隨著生活方式和飲食習慣的改變，胃癌的發(fā)病率急劇上升，給家庭和社會造成巨大的經(jīng)濟負擔，已成為威脅人們健康乃至生命的一大兇手[2,3]。當前手術(shù)治療是胃癌患者主要綜合治療方式。幾十年來，放療技術(shù)、外科手術(shù)及大量有效抗腫瘤藥物的出現(xiàn)，提高了胃癌的治療有效率，但其遠期生存率并未明顯提高，且預后仍較差。因此，胃癌發(fā)病的危險因素已成為消化病理研究的重要領(lǐng)域之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)，血清學標志物檢測是目前常用一種非創(chuàng)性診斷方法，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用，其對于延長患者生存時間、提高診斷率以及改善預后具有重要的臨床意義[5]。以往研究者發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)可以作為一種腫瘤標志物來對腫瘤的診斷和預后進行評估，miR-125b在肝癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等眾多生物學過程相關(guān)[6]。然而關(guān)于miR-125b在胃癌患者血清中的表達情況與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性以及預后的影響因素的研究筆者尚未見具體研究結(jié)果。鑒于此，我們對近年來收治的胃癌患者進行回顧性分析，通過胃癌患者血清中miR-125b的表達水平，分析其與臨床病理因素的關(guān)系，探討其與胃癌患者預后的影響因素，以便為胃癌疾病監(jiān)測及預后改善提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年1月海軍軍醫(yī)大學附屬第一醫(yī)院接受治療并經(jīng)病理檢查確診的胃癌患者113例，其中男65例，女48例；年齡25～80歲，平均年齡(62.91±9.06)歲；按照Lauren分型：腸型68例，彌漫型33例，混合型12例。另外選擇同期113例對照組血清標本來自醫(yī)院體檢中心胃鏡檢查及各項化驗指標均正常者，其中男60例，女53例；年齡30～85歲，平均年齡(60.53±9.87)歲；Lauren分型：腸型54例，彌漫型50例，混合型9例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核并批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合胃癌的臨床診斷標準[7]，且均為經(jīng)組織病理活檢首次確診為胃癌的患者；②年齡20～85歲，性別不限；③臨床分期、病理分化明確且入院前未接受化療或放療等其他治療。

1.2.2 排除標準：①伴有自身免疫性疾病、糖尿病、血液性疾病等；②合并其他部位原發(fā)腫瘤；③酗酒、藥癮、長期服用激素、或非甾體抗炎藥物者；④妊娠與哺乳期女性；⑤存在血液系統(tǒng)疾病包括各種白血病等。

1.3 方法

1.3.1 血清miR-125b檢測:要求所有受檢者在空腹狀態(tài)下，次日早晨約8∶00時抽取肘靜脈血5 ml，嚴格按照試劑盒說明書指導操作，均采用Trizol法(ELISA)提取血清RNA，Nanodrop(Thermo公司)測定血清miR-125b含量，置于離心機中以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，用一次性塑料膠頭滴管移取上清液放入2 ml 凍存管中，然后分離血清標記后于-80℃冰箱凍存待測；然后利用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成miRNA，反應(yīng)條件為：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min；4℃保存。反應(yīng)體系為 20 μl：混合加入TaqMan?Universal PCR 混合試劑Ⅱ(不含UNG)分別加入TaqMan?hsa-miR-125b引物(20×)或內(nèi)參 Taq Man?U6sn RNA引物(20×)10 μl，上述擴增的 cDNA(1∶20 稀釋)2 μl，去核酸酶水7.0 μl，引物1 μl。通過美國BIO-RAD公司CFX96實時熒光定量PCR儀進行檢測。反應(yīng)參數(shù)：95℃，1 min；95℃，15 s；60℃，45 s；共40個循環(huán)。見 表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列

1.3.2 隨訪調(diào)查:通過病案室的病案查詢系統(tǒng)，查閱手術(shù)記錄單、體溫單、病程記錄、醫(yī)囑單、各種輔助檢查單等，獲得調(diào)查對象的相關(guān)臨床資料，并使用統(tǒng)一調(diào)查表逐項登記，登記內(nèi)容包括性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等檢查結(jié)果。然后對所有術(shù)后患者進行為期3年的門診復診或電話隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪至今，無患者失訪。

2 結(jié)果

2.1 2組血清miR-125b表達水平比較 研究組的miR-125b表達水平(0.37±0.09)顯著低于對照組的(1.05±0.22)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清miR-125b表達水平比較

2.2 血清miR-125b表達水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 以中位0.37為分界點在胃癌患者血清miR-125b表達水平中，將113例胃癌者分為高表達組(65例)和低表達組(48例)。miR-125b水平與腫瘤大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 胃癌患者血清miR-125b表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

2.3 胃癌患者總體生存率情況 113例胃癌患者中死亡48例，生存65例，生存率為57.53%，中位生存時間(38.36±4.22)個月。Kaplan-Meier分析法繪制胃癌患者3年生存曲線顯示，miR-125b低表達者3年總生存率43.08%(28/65)，顯著低于miR-125b高表達者的3年總生存率93.75%(45/48)(χ2=31.003，P<0.001)。早期(Ⅰ～Ⅱ期)胃癌患者中miR-125b低表達者3年總生存率83.34%(25/30)，稍低于miR-125b高表達者的3年總生存率100.00%(20/20)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；晚期(Ⅲ～Ⅳ期)胃癌患者中miR-125b低表達者的3年總生存率36.73%(18/49)顯著低于miR-125b高表達者的3年總生存率71.42%(10/14)(χ2=5.308，P=0.021)。見圖1。

圖1 血清miR-125b表達水平與胃癌患者3年總生存率的關(guān)系;A全部113例胃癌患者；B早期胃癌患者50例；C晚期胃癌63例患者

2.4 單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示：腫瘤大小、病理分化、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-125b表達水平與胃癌患者3年總生存率有相關(guān)性(P<0.05)。見表4。

表4 影響胃癌患者3年總生存率的單因素分析 例(%)

2.5 多因素分析 將胃癌患者預后有無生存為因變量(有=1，無=0)，以單因素分析有意義的變量為自變量進行二分類Logistic逐步回歸分析，結(jié)果顯示：腫瘤大小、病理分化、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期是影響胃癌預后的危險因素；則病理分化程度低、T分期高、TNM分期高及miR-125b低表達是影響胃癌患者預后的獨立因素。見表5。

表5 影響胃癌患者預后的Logistic回歸分析

3 討論

由于胃癌具有易復發(fā)、惡心程度高等特點，手術(shù)切除率也較低，胃癌患者的5年總生存率僅在30%～50%，這將不僅會造成患者的消化系統(tǒng)損害，而且可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，影響肝腎及呼吸功能，嚴重者出現(xiàn)惡病質(zhì)，最終危及患者生命[8,9]。除此之外，目前對胃癌預后的預測主要依靠病理(包括組織學分型、侵襲性和轉(zhuǎn)移)，影像學表現(xiàn)(用于分期)，以及其他的臨床特點(年齡和基礎(chǔ)疾病等)，這些因素共同決定患者的進一步治療。但是，這些傳統(tǒng)的臨床病理特點具有明顯的局限性。故探討胃癌的發(fā)生發(fā)展機制，明確有效的預測和預后血清標志物有利于胃癌的治療和預后改善頗為關(guān)鍵。

微小核糖核酸(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，其長度約22個核苷酸，它廣泛存在于真核生物中，并可通過與相關(guān)信使核糖核酸分子3’非編碼區(qū)互補配對，接著與Argonaute蛋白結(jié)合形成沉默復合體，進而介導靶基因mRNA降解或翻譯抑制，從而達到負調(diào)控基因表達[10]。已有的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與許多疾病發(fā)生密切相關(guān)，還起到原癌基因、抑癌基因的作用，并具有明顯的腫瘤組織特異性與表達穩(wěn)定性[11]。

miR-125b屬于microRNA-125(miR-125)家族成員，研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌、肝癌、淋巴瘤等惡性腫瘤中扮演癌基因或抑癌基因角色，但其在胃癌中的表達及作用尚不十分明確[12]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b在癌旁正常肺組織中無異常，在肺癌組織中存在基因突變，且miR-125b基因突變與癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈顯著正相關(guān)[13-15]。

在本研究中，血清miR-125b表達水平在胃癌患者中顯著降低，其表達降低程度說明與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。但是，miR-125b與胃癌關(guān)系及其對胃癌作用的相關(guān)研究仍較少，且其具體機制仍不十分明確。本研究進一步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-125b表達異常與腫瘤大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、以及TNM分期有關(guān)，說明miR-125b在胃癌疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的抑癌作用。隨訪調(diào)查顯示，隨訪至今，113例胃癌患者中共有死亡48例，生存65例，生存率為57.53%；本研究還發(fā)現(xiàn)miR-125b低表達者的3年總生存率低于高表達者的3年總生存率，并且晚期(Ⅲ～Ⅳ期)胃癌患者中miR-125b低表達者的3年總生存率也明顯低于miR-125b高表達者。采用單因素和多因素Logistic回歸分析同時發(fā)現(xiàn)：miR-125b表達與腫瘤大小、病理分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，表明miR-125b參與胃癌疾病的發(fā)展；其中病理分化程度低、T分期高、TNM分期高及miR-125b表達水平低是影響胃癌患者預后的獨立危險因素，由此說明，miR-125b水平可作為胃癌患者預后的預測指標，是影響預后的獨立危險因素。

綜上所述，血清miR-125b在胃癌組織中呈低表達，與胃癌的腫瘤大小、病理分化程度、TNM分期有關(guān)，且血清miR-125b水平可作為胃癌患者預后的預測指標，是影響預后的獨立危險因素。這不僅為闡明胃癌發(fā)病機制提供了新的理論依據(jù)，也為腫瘤的診治提供了新的潛在靶點，但其具體分子機制仍有待進一步深入研究。