周 翔，興 旺，楊 軍，孫來軍，王錄紅，周婉婷，王雪倩，李思琪，汪 曼

（1黑龍江大學(xué)國家甜菜種質(zhì)中期庫/黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)/黑龍江省電子工程省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜作為國內(nèi)主要的糖料作物之一，有著較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值。在種植、收獲和收獲后處理過程中，種子的活力直接影響甜菜的成活率，這對(duì)甜菜產(chǎn)量和質(zhì)量至關(guān)重要。同時(shí)，種子活力測定是品種實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，為了提高產(chǎn)量和質(zhì)量，種子活力的測定方法一直在不斷探尋中。

種子發(fā)芽率、出苗率、幼苗生長勢、幼苗的抗逆性和適應(yīng)性都是檢測種子活力的重要指標(biāo)[1]。長期以來，種子活力的測定方式主要是實(shí)驗(yàn)室發(fā)芽實(shí)驗(yàn)[2]，但結(jié)果與實(shí)際種植過程中的數(shù)據(jù)還是有一定的差別，后期又采用了多種化學(xué)和物理的方法進(jìn)行種子實(shí)驗(yàn)，如四氮唑(TTC)法、人工加速老化法、高溫處理法、高光譜技術(shù)和近紅外光譜測定法[3-4]。TTC法是操作簡便、快速鑒定種子活力的方法，已經(jīng)被廣泛普及，但由于甜菜種子較小、外殼去除難、種皮帶色以及種子內(nèi)淀粉含量較高等原因，甜菜種子染色比較困難[5-6]，并不適用TTC法。

近紅外高光譜技術(shù)是一種對(duì)種子無損傷的檢測技術(shù)[7]，利用近紅外高光和圖像技術(shù)對(duì)種子進(jìn)行掃描來判斷種子的活力情況，以此建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂删珳?zhǔn)預(yù)測后期未經(jīng)處理的種子活力[8]?？梢允褂贸^1000 nm的近紅外光譜區(qū)域結(jié)合不同模型來預(yù)測種子的活力[9-10]，以此來判斷的種子的發(fā)芽能力。

筆者采用高溫老化處理法對(duì)種子進(jìn)行老化處理，產(chǎn)生足夠的不可存活及活力不高的種子，以在不同時(shí)期開始發(fā)芽出苗為標(biāo)準(zhǔn)，確定種子活力用于構(gòu)建分類模型[11]，再基于標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換、去趨勢校正、Savitzky-Golay平滑處理、一階差分和二階差分5種近紅外高光譜預(yù)處理法建立種子活力的智能檢測模型，根據(jù)預(yù)處理方法及提取特征的不同可以得出5種檢測模型的準(zhǔn)確率，從中選擇準(zhǔn)確率最高的模型預(yù)測甜菜種子的發(fā)芽率，再與老化處理后發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際發(fā)芽率進(jìn)行比對(duì)，來驗(yàn)證其模型預(yù)測性能的準(zhǔn)確性。旨在確定近紅外高光譜技術(shù)在甜菜種子活力的檢測方面具有較高的準(zhǔn)確性，為后期檢測甜菜種子活力提供了一種更加便捷、快速的新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2020年12月—2021年3月在黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

以國家甜菜種質(zhì)中期庫提供的‘TD244’的甜菜種子為實(shí)驗(yàn)材料，將種子自然風(fēng)干，從中選取1200粒甜菜種子作為實(shí)驗(yàn)樣本（便于測量種子活力），將1200粒種子分為100組，每組12粒，分組依次編號(hào)后裝入塑封袋中密封備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 近紅外高光譜圖像采集 由于每組甜菜種子發(fā)芽率不同，活力值也具有一定的差別，因此可以作為近紅外光譜的檢測樣本。將分完組的甜菜種子按照組別依次利用型號(hào)為SOC710的近紅外高光譜成像儀來采集1200粒甜菜種子樣本的高光譜圖像（圖1）[12-13]。其中光譜成像儀波長范圍為381～1040 nm，光譜分辨率為4.68 nm。在鋁制框架四周固定4個(gè)75 W的鹵素?zé)糇鳛槌上裣到y(tǒng)的光源。采集甜菜種子高光譜圖像時(shí)，將甜菜種子水平放置在載物臺(tái)上。為防止外界光線進(jìn)入影響光譜采集，使用遮光率100%的遮光蓬覆蓋鋁制框架四周，將采集到的甜菜種子高光譜圖像通過USB接口傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中存儲(chǔ)、處理[14]。

圖1 甜菜種子原始光譜

1.3.2 光譜提取與預(yù)處理 對(duì)采集的甜菜種子高光譜圖像進(jìn)行黑白板校正，并對(duì)校正后的圖像依次進(jìn)行二值化、形態(tài)學(xué)、輪廓提取等操作，提取甜菜種子的感興趣區(qū)域。以每一粒甜菜種子感興趣區(qū)域中所有像素點(diǎn)的平均光譜作為該粒甜菜種子的平均光譜[15-16]。為消除光譜中存在的基線平移與散射等問題，對(duì)比分析了標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)、去趨勢校正(DET)、Savitzky-Golay平滑處理(SG)、一階差分(1D)和二階差分(2D)5種光譜預(yù)處理方法[17-18]，從不同角度消除高光譜圖像采集時(shí)外界干擾的影響。

1.3.3 預(yù)測模型的構(gòu)建 經(jīng)過5種預(yù)處理后再基于高斯核函數(shù)(SVM-RBF)的監(jiān)督分類方法，通過尋找最大化數(shù)據(jù)間距超平面實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)分類[19]。SVM對(duì)于線性分類問題有很強(qiáng)的優(yōu)勢，但是對(duì)于非線性分類問題分類能力明顯不足。因此需要結(jié)合RBF處理非線性分類問題，通過模型參數(shù)獲得更精準(zhǔn)的預(yù)測模型。將輸入變量通過高斯核函數(shù)變換映射到高維空間中，在變換之后的空間中求解最優(yōu)分類面以獲得決策函數(shù)、全局最優(yōu)解，從而獲得更多的甜菜光譜信息，提高模型識(shí)別的平均時(shí)間和準(zhǔn)確性[20]。再根據(jù)所提取的甜菜種子光譜信息建立SVM-RBF發(fā)芽率預(yù)測模型，通過5種不同預(yù)處理后的智能檢測模型對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本中的1200粒種子進(jìn)行一一掃描，來獲得每一粒種子發(fā)芽情況，以此來獲得5種預(yù)處理后檢測模型的預(yù)測準(zhǔn)確率。

SVM的原始問題是求解式(1)所示的獲取最優(yōu)化問題。

式中ξi為松弛因子，C為懲罰因子。

為解決該問題，首先將低維空間中的樣本數(shù)據(jù)通過映射函數(shù)φ(x)映射到高維空間，并利用拉格朗日乘子法對(duì)其對(duì)偶問題進(jìn)行求解，即式(2)。

這里引入高斯核函數(shù)[式(3)]對(duì)上述問題進(jìn)行求解即可得最優(yōu)劃分超平面。

所求得的最優(yōu)劃分超平面如式(4)所示。

1.3.4 發(fā)芽試驗(yàn)

（1）樣品準(zhǔn)備。從采集完高光譜圖像的1200粒甜菜種子中稱取5.0 g，用水浸泡4 h后揉搓種子并用清水清洗直至種子外殼完全脫落，將種子放置在5～10℃的室內(nèi)自然風(fēng)干。

（2）水分測定。將自然風(fēng)干的甜菜種子放入微量天平中進(jìn)行稱重，在烘箱加熱至110～115℃后，將稱取好的樣品種子放在烘箱內(nèi)部上層，烘干8 h后取出放入干燥器內(nèi)冷卻至室溫，再進(jìn)行稱重。若同一樣品2次稱重差值不超過0.2%，其恒重結(jié)果可用2次結(jié)果的平均值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反之重新實(shí)驗(yàn)。根據(jù)烘干后失去質(zhì)量計(jì)算種子水分，如式(5)。

式中，H代表含水量，M1代表樣品盒+蓋的質(zhì)量，M2代表樣品盒+蓋及樣品烘干前的質(zhì)量，M3代表樣品盒+蓋及樣品烘干后的質(zhì)量。結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后1位。

（3）水分調(diào)整。根據(jù)測定完水分的甜菜種子的含水量，再通過計(jì)算得出所需要添加的水量，然后將種子的含水量調(diào)整至24%。并按照此方法將所有烘干完的種子水分都調(diào)整至24%后再放入密閉容器中，在10℃條件下放置24 h。

（4）老化處理。從密閉容器中取出所有調(diào)整至24%水分的甜菜種子，一粒一袋依次編號(hào)放入鋁箔袋中，用封口機(jī)進(jìn)行加熱密封，然后將鋁箔袋放入45℃水浴鍋中浸泡2、4、6天后取出，在人工控制的高溫高濕(40～45℃)條件下可以加速種子老化，在較短的時(shí)間內(nèi)使甜菜種子快速劣變。

（5）發(fā)芽試驗(yàn)。本次發(fā)芽試驗(yàn)嚴(yán)格按照《糖用甜菜種子》[21]中發(fā)芽實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。將老化處理后取出的種子沖洗后放入0.3%～0.5%福美雙溶液中進(jìn)行浸泡10 min后室內(nèi)陰干。同時(shí)，發(fā)芽盒要用0.1% NaClO溶液進(jìn)行消毒、沖洗、晾干后在發(fā)芽盒底部鋪上發(fā)芽紙，再噴上32～34 mL蒸餾水使發(fā)芽紙褶皺浸濕。

將晾干的甜菜種子放入發(fā)芽盒內(nèi)，每個(gè)發(fā)芽紙的褶皺上放4粒種子，相互錯(cuò)開后折疊發(fā)芽紙，再蓋緊發(fā)芽盒，并用保鮮膜將發(fā)芽盒四周包裹后放置在23～25℃發(fā)芽箱內(nèi)的發(fā)芽架上進(jìn)行為期8天的發(fā)芽鑒定。在發(fā)芽鑒定過程中，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，每天對(duì)發(fā)芽盒內(nèi)種子進(jìn)行觀測，對(duì)于發(fā)育良好的種子按照組別序號(hào)進(jìn)行一一對(duì)應(yīng)計(jì)數(shù)；對(duì)于可疑、損傷、出苗不明顯的種子在實(shí)驗(yàn)周期最后一天再觀察其出苗情況并計(jì)數(shù)；對(duì)于發(fā)霉和腐爛的種子要及時(shí)挑出，并對(duì)其進(jìn)行對(duì)應(yīng)標(biāo)注[22-23]。每天檢查發(fā)芽情況并按照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)種子施用一定的水分保證發(fā)芽紙褶皺完全?濕，在8天后，檢查所有樣品種子，同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)來判斷其發(fā)芽率，將胚芽長度超過1 cm的種子視為發(fā)芽和存活[24]，反之則視為死亡，以此來計(jì)算出甜菜種子的實(shí)際發(fā)芽率。

實(shí)驗(yàn)根據(jù)采集的1200粒甜菜種子圖像建立了SVM-RBF發(fā)芽率預(yù)測模型，經(jīng)過近紅外光譜技術(shù)的5種不同預(yù)處理后得出的預(yù)測發(fā)芽率與發(fā)芽實(shí)驗(yàn)得出的實(shí)際發(fā)芽率進(jìn)行對(duì)比，從中選擇預(yù)測準(zhǔn)確率最好的模型對(duì)甜菜種子的活力進(jìn)行預(yù)測。同時(shí)，為了驗(yàn)證預(yù)測模型的準(zhǔn)確性和泛化性能，從未參加實(shí)驗(yàn)的備用甜菜種子中隨機(jī)挑選出同品種、同大小的種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3.5 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 首先從備用甜菜種子中隨機(jī)選擇500粒，并對(duì)這500粒甜菜種子按順序標(biāo)號(hào)，依次進(jìn)行近紅外高光譜掃描，并采集高光譜圖像，再利用預(yù)測準(zhǔn)確率最好的智能預(yù)測模型來對(duì)這500粒甜菜種子進(jìn)行活力預(yù)測[25]。將采集完高光譜圖像的甜菜種子按照上文所述的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)來獲取實(shí)際發(fā)芽率，再將甜菜種子的實(shí)際發(fā)芽狀態(tài)與模型的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型預(yù)測結(jié)果分析

利用所提取的甜菜種子光譜信息建立SVM-RBF發(fā)芽率預(yù)測模型，以經(jīng)過不同光譜預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)作為模型輸入，甜菜樣本所對(duì)應(yīng)的發(fā)芽狀態(tài)作為輸出，訓(xùn)練預(yù)測模型[26]。經(jīng)過參數(shù)調(diào)節(jié)與模型訓(xùn)練獲得最好性能模型，而此時(shí)最好SVM-RBF模型的懲罰參數(shù)為30，gamma參數(shù)為59，在此參數(shù)下可以得出不同預(yù)處理下SVM-RBF的預(yù)測準(zhǔn)確率如圖2所示。種子光譜經(jīng)過一階差分(1D)處理后預(yù)測性能最好，其預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)到91.92%。甜菜種子光譜經(jīng)Savitzky-Golay平滑處理(SG)與二階差分(2D)處理后SVM-RBF的預(yù)測性能也較好，預(yù)測準(zhǔn)確率均在85%以上。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)與去趨勢校正(DET)處理的種子光譜SVMRBF的預(yù)測準(zhǔn)確率較低，并不能使模型獲得較高的預(yù)測性能。

圖2 不同預(yù)處理下的模型預(yù)測準(zhǔn)確率

2.2 發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果分析

在本次實(shí)驗(yàn)中，發(fā)芽天數(shù)被認(rèn)為是檢測種子活力的重要標(biāo)準(zhǔn)，在實(shí)驗(yàn)早期發(fā)芽的種子被認(rèn)為是具有高活力的種子，在實(shí)驗(yàn)周期后幾天發(fā)芽的種子被認(rèn)為是具有一般活力的種子，而在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)并沒有發(fā)芽的種子被認(rèn)為是不具有活力的[27]?；谶@個(gè)結(jié)論，可以將在發(fā)芽期間內(nèi)的種子被分為3種類型，在4天內(nèi)發(fā)芽的種子代表活力最旺盛的種子，在4～8天內(nèi)發(fā)芽的種子代表活力一般的種子，未發(fā)芽的種子代表無活力的種子。

從表1可以看出，老化2天后的甜菜種子發(fā)芽率最高，為60.16%；其次為老化4天的甜菜種子，發(fā)芽率為52.73%；最后為老化6天后的甜菜種子，發(fā)芽率為47.70%。而從種子活力的角度來看，老化2天后的甜菜種子活力要高于其他2種老化周期的種子活力，同時(shí)，隨著老化周期的延長，種子的活力和發(fā)芽率都在減少；而高活力種子和存活種子的比例也在減少。

表1 發(fā)芽試驗(yàn)種子活力測定結(jié)果

2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)利用預(yù)測準(zhǔn)確率最好的一階差分處理后智能預(yù)測模型來對(duì)這500粒甜菜種子進(jìn)行活力預(yù)測，得出的預(yù)測種子發(fā)芽率與發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中甜菜種子的實(shí)際發(fā)芽率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，模型預(yù)測的發(fā)芽種子總數(shù)為252，未發(fā)芽種子總數(shù)為248；發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中實(shí)際發(fā)芽種子總數(shù)為275，未發(fā)芽種子總數(shù)為225。根據(jù)式(6)可以得出一階差分處理后智能預(yù)測模型的預(yù)測準(zhǔn)確率為88.2%，能夠較準(zhǔn)確地對(duì)甜菜種子發(fā)芽狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測。模型預(yù)測種子總數(shù)與實(shí)際發(fā)芽種子總數(shù)如表2所示。

表2 模型預(yù)測與發(fā)芽實(shí)驗(yàn)結(jié)果比對(duì)

3 結(jié)論

將模型預(yù)測的發(fā)芽率和實(shí)際發(fā)芽實(shí)驗(yàn)得出的發(fā)芽率進(jìn)行比對(duì)，可以得出近紅外光譜技術(shù)在預(yù)測甜菜種子的發(fā)芽率上有著較高的準(zhǔn)確率，能夠較準(zhǔn)確地區(qū)分發(fā)芽與未發(fā)芽的甜菜種子。從結(jié)果可以看出，通過近紅外光譜對(duì)甜菜樣品種子進(jìn)行掃描處理，得出近紅外高光譜圖像后，再綜合多種預(yù)處理方法建立的智能檢測模型是一種快速、便捷且無損于種子的檢測方法，實(shí)現(xiàn)了種子活力的快速、有效鑒定。

4 討論

近紅外光譜技術(shù)作為一種快速測定種子活力的方法，可以顯著區(qū)分出種子活力的高低，提高作物育種的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前，近紅外光譜技術(shù)在檢測作物種子活力方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。楊東風(fēng)等[28]采用近紅外光譜構(gòu)建了6個(gè)模型對(duì)玉米的9個(gè)主成分進(jìn)行分析，但由于采用的預(yù)處理方法和特征提取方法不同，影響了識(shí)別的平均時(shí)間和準(zhǔn)確性，不便于分析。而在本實(shí)驗(yàn)中采取了5種光譜預(yù)處理方法，從不同角度消除高光譜圖像采集時(shí)外界干擾的影響，減小了處理方法不同對(duì)識(shí)別準(zhǔn)確性的影響；同時(shí)李晉華等[29]采集玉米的近紅外光譜，對(duì)玉米的4個(gè)主成分進(jìn)行了分析，但由于樣品裝樣方式的不同和采集的光譜速度慢等原因，得到的光譜信息量較低。而本次實(shí)驗(yàn)中基于模型的變化，用于選擇與種子發(fā)芽能力具有最佳變量，通過不同的預(yù)處理方法來選擇最佳變量，為獲得盡可能少的變量，每種方法都使用了更高的閾值來獲取更多的光譜信息來保證模型的準(zhǔn)確性[30-31]。

本實(shí)驗(yàn)在獲取種子高光譜圖像時(shí)，選擇的是最佳波長范圍而不是整個(gè)光譜范圍，減小了外界干擾并獲取了更多的光譜信息，圖像獲取完后再基于標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換、去趨勢校正、Savitzky-Golay平滑處理、一階差分和二階差分等5種光譜預(yù)處理后建立的智能檢測模型[32]?？梢缘贸鲞@5種模型對(duì)甜菜種子的活力預(yù)測精度分別為75.77%、78.11%、85.17%、91.92%和88.25%，而一階差分預(yù)處理后建立的預(yù)測模型的預(yù)測性能是預(yù)處理方法中最好的。但在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)于變量的選擇是不能控制的，變量越多其模型的預(yù)測準(zhǔn)確性會(huì)降低，因此對(duì)于擴(kuò)大不同預(yù)處理方法來選擇最佳變量，來獲取更準(zhǔn)確的模型。這不僅在學(xué)術(shù)領(lǐng)域有更高的價(jià)值，而且對(duì)于今后作物種子活力的預(yù)測提供更為精準(zhǔn)的方法。