周 翔，興 旺，楊 軍，孫來(lái)軍，王錄紅，周婉婷，王雪倩，李思琪，汪 曼

（1黑龍江大學(xué)國(guó)家甜菜種質(zhì)中期庫(kù)/黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)/黑龍江省電子工程省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜作為國(guó)內(nèi)主要的糖料作物之一，有著較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值。在種植、收獲和收獲后處理過(guò)程中，種子的活力直接影響甜菜的成活率，這對(duì)甜菜產(chǎn)量和質(zhì)量至關(guān)重要。同時(shí)，種子活力測(cè)定是品種實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，為了提高產(chǎn)量和質(zhì)量，種子活力的測(cè)定方法一直在不斷探尋中。

種子發(fā)芽率、出苗率、幼苗生長(zhǎng)勢(shì)、幼苗的抗逆性和適應(yīng)性都是檢測(cè)種子活力的重要指標(biāo)[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，種子活力的測(cè)定方式主要是實(shí)驗(yàn)室發(fā)芽實(shí)驗(yàn)[2]，但結(jié)果與實(shí)際種植過(guò)程中的數(shù)據(jù)還是有一定的差別，后期又采用了多種化學(xué)和物理的方法進(jìn)行種子實(shí)驗(yàn)，如四氮唑(TTC)法、人工加速老化法、高溫處理法、高光譜技術(shù)和近紅外光譜測(cè)定法[3-4]。TTC法是操作簡(jiǎn)便、快速鑒定種子活力的方法，已經(jīng)被廣泛普及，但由于甜菜種子較小、外殼去除難、種皮帶色以及種子內(nèi)淀粉含量較高等原因，甜菜種子染色比較困難[5-6]，并不適用TTC法。

近紅外高光譜技術(shù)是一種對(duì)種子無(wú)損傷的檢測(cè)技術(shù)[7]，利用近紅外高光和圖像技術(shù)對(duì)種子進(jìn)行掃描來(lái)判斷種子的活力情況，以此建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂删珳?zhǔn)預(yù)測(cè)后期未經(jīng)處理的種子活力[8]?？梢允褂贸^(guò)1000 nm的近紅外光譜區(qū)域結(jié)合不同模型來(lái)預(yù)測(cè)種子的活力[9-10]，以此來(lái)判斷的種子的發(fā)芽能力。

筆者采用高溫老化處理法對(duì)種子進(jìn)行老化處理，產(chǎn)生足夠的不可存活及活力不高的種子，以在不同時(shí)期開(kāi)始發(fā)芽出苗為標(biāo)準(zhǔn)，確定種子活力用于構(gòu)建分類模型[11]，再基于標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換、去趨勢(shì)校正、Savitzky-Golay平滑處理、一階差分和二階差分5種近紅外高光譜預(yù)處理法建立種子活力的智能檢測(cè)模型，根據(jù)預(yù)處理方法及提取特征的不同可以得出5種檢測(cè)模型的準(zhǔn)確率，從中選擇準(zhǔn)確率最高的模型預(yù)測(cè)甜菜種子的發(fā)芽率，再與老化處理后發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際發(fā)芽率進(jìn)行比對(duì)，來(lái)驗(yàn)證其模型預(yù)測(cè)性能的準(zhǔn)確性。旨在確定近紅外高光譜技術(shù)在甜菜種子活力的檢測(cè)方面具有較高的準(zhǔn)確性，為后期檢測(cè)甜菜種子活力提供了一種更加便捷、快速的新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2020年12月—2021年3月在黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

以國(guó)家甜菜種質(zhì)中期庫(kù)提供的‘TD244’的甜菜種子為實(shí)驗(yàn)材料，將種子自然風(fēng)干，從中選取1200粒甜菜種子作為實(shí)驗(yàn)樣本（便于測(cè)量種子活力），將1200粒種子分為100組，每組12粒，分組依次編號(hào)后裝入塑封袋中密封備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 近紅外高光譜圖像采集 由于每組甜菜種子發(fā)芽率不同，活力值也具有一定的差別，因此可以作為近紅外光譜的檢測(cè)樣本。將分完組的甜菜種子按照組別依次利用型號(hào)為SOC710的近紅外高光譜成像儀來(lái)采集1200粒甜菜種子樣本的高光譜圖像（圖1）[12-13]。其中光譜成像儀波長(zhǎng)范圍為381～1040 nm，光譜分辨率為4.68 nm。在鋁制框架四周固定4個(gè)75 W的鹵素?zé)糇鳛槌上裣到y(tǒng)的光源。采集甜菜種子高光譜圖像時(shí)，將甜菜種子水平放置在載物臺(tái)上。為防止外界光線進(jìn)入影響光譜采集，使用遮光率100%的遮光蓬覆蓋鋁制框架四周，將采集到的甜菜種子高光譜圖像通過(guò)USB接口傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中存儲(chǔ)、處理[14]。

圖1 甜菜種子原始光譜

1.3.2 光譜提取與預(yù)處理 對(duì)采集的甜菜種子高光譜圖像進(jìn)行黑白板校正，并對(duì)校正后的圖像依次進(jìn)行二值化、形態(tài)學(xué)、輪廓提取等操作，提取甜菜種子的感興趣區(qū)域。以每一粒甜菜種子感興趣區(qū)域中所有像素點(diǎn)的平均光譜作為該粒甜菜種子的平均光譜[15-16]。為消除光譜中存在的基線平移與散射等問(wèn)題，對(duì)比分析了標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)、去趨勢(shì)校正(DET)、Savitzky-Golay平滑處理(SG)、一階差分(1D)和二階差分(2D)5種光譜預(yù)處理方法[17-18]，從不同角度消除高光譜圖像采集時(shí)外界干擾的影響。

1.3.3 預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建 經(jīng)過(guò)5種預(yù)處理后再基于高斯核函數(shù)(SVM-RBF)的監(jiān)督分類方法，通過(guò)尋找最大化數(shù)據(jù)間距超平面實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)分類[19]。SVM對(duì)于線性分類問(wèn)題有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)于非線性分類問(wèn)題分類能力明顯不足。因此需要結(jié)合RBF處理非線性分類問(wèn)題，通過(guò)模型參數(shù)獲得更精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)模型。將輸入變量通過(guò)高斯核函數(shù)變換映射到高維空間中，在變換之后的空間中求解最優(yōu)分類面以獲得決策函數(shù)、全局最優(yōu)解，從而獲得更多的甜菜光譜信息，提高模型識(shí)別的平均時(shí)間和準(zhǔn)確性[20]。再根據(jù)所提取的甜菜種子光譜信息建立SVM-RBF發(fā)芽率預(yù)測(cè)模型，通過(guò)5種不同預(yù)處理后的智能檢測(cè)模型對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本中的1200粒種子進(jìn)行一一掃描，來(lái)獲得每一粒種子發(fā)芽情況，以此來(lái)獲得5種預(yù)處理后檢測(cè)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。

SVM的原始問(wèn)題是求解式(1)所示的獲取最優(yōu)化問(wèn)題。

式中ξi為松弛因子，C為懲罰因子。

為解決該問(wèn)題，首先將低維空間中的樣本數(shù)據(jù)通過(guò)映射函數(shù)φ(x)映射到高維空間，并利用拉格朗日乘子法對(duì)其對(duì)偶問(wèn)題進(jìn)行求解，即式(2)。

這里引入高斯核函數(shù)[式(3)]對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行求解即可得最優(yōu)劃分超平面。

所求得的最優(yōu)劃分超平面如式(4)所示。

1.3.4 發(fā)芽試驗(yàn)

（1）樣品準(zhǔn)備。從采集完高光譜圖像的1200粒甜菜種子中稱取5.0 g，用水浸泡4 h后揉搓種子并用清水清洗直至種子外殼完全脫落，將種子放置在5～10℃的室內(nèi)自然風(fēng)干。

（2）水分測(cè)定。將自然風(fēng)干的甜菜種子放入微量天平中進(jìn)行稱重，在烘箱加熱至110～115℃后，將稱取好的樣品種子放在烘箱內(nèi)部上層，烘干8 h后取出放入干燥器內(nèi)冷卻至室溫，再進(jìn)行稱重。若同一樣品2次稱重差值不超過(guò)0.2%，其恒重結(jié)果可用2次結(jié)果的平均值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反之重新實(shí)驗(yàn)。根據(jù)烘干后失去質(zhì)量計(jì)算種子水分，如式(5)。

式中，H代表含水量，M1代表樣品盒+蓋的質(zhì)量，M2代表樣品盒+蓋及樣品烘干前的質(zhì)量，M3代表樣品盒+蓋及樣品烘干后的質(zhì)量。結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后1位。

（3）水分調(diào)整。根據(jù)測(cè)定完水分的甜菜種子的含水量，再通過(guò)計(jì)算得出所需要添加的水量，然后將種子的含水量調(diào)整至24%。并按照此方法將所有烘干完的種子水分都調(diào)整至24%后再放入密閉容器中，在10℃條件下放置24 h。

（4）老化處理。從密閉容器中取出所有調(diào)整至24%水分的甜菜種子，一粒一袋依次編號(hào)放入鋁箔袋中，用封口機(jī)進(jìn)行加熱密封，然后將鋁箔袋放入45℃水浴鍋中浸泡2、4、6天后取出，在人工控制的高溫高濕(40～45℃)條件下可以加速種子老化，在較短的時(shí)間內(nèi)使甜菜種子快速劣變。

（5）發(fā)芽試驗(yàn)。本次發(fā)芽試驗(yàn)嚴(yán)格按照《糖用甜菜種子》[21]中發(fā)芽實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。將老化處理后取出的種子沖洗后放入0.3%～0.5%福美雙溶液中進(jìn)行浸泡10 min后室內(nèi)陰干。同時(shí)，發(fā)芽盒要用0.1% NaClO溶液進(jìn)行消毒、沖洗、晾干后在發(fā)芽盒底部鋪上發(fā)芽紙，再噴上32～34 mL蒸餾水使發(fā)芽紙褶皺浸濕。

將晾干的甜菜種子放入發(fā)芽盒內(nèi)，每個(gè)發(fā)芽紙的褶皺上放4粒種子，相互錯(cuò)開(kāi)后折疊發(fā)芽紙，再蓋緊發(fā)芽盒，并用保鮮膜將發(fā)芽盒四周包裹后放置在23～25℃發(fā)芽箱內(nèi)的發(fā)芽架上進(jìn)行為期8天的發(fā)芽鑒定。在發(fā)芽鑒定過(guò)程中，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，每天對(duì)發(fā)芽盒內(nèi)種子進(jìn)行觀測(cè)，對(duì)于發(fā)育良好的種子按照組別序號(hào)進(jìn)行一一對(duì)應(yīng)計(jì)數(shù)；對(duì)于可疑、損傷、出苗不明顯的種子在實(shí)驗(yàn)周期最后一天再觀察其出苗情況并計(jì)數(shù)；對(duì)于發(fā)霉和腐爛的種子要及時(shí)挑出，并對(duì)其進(jìn)行對(duì)應(yīng)標(biāo)注[22-23]。每天檢查發(fā)芽情況并按照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)種子施用一定的水分保證發(fā)芽紙褶皺完全?濕，在8天后，檢查所有樣品種子，同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷其發(fā)芽率，將胚芽長(zhǎng)度超過(guò)1 cm的種子視為發(fā)芽和存活[24]，反之則視為死亡，以此來(lái)計(jì)算出甜菜種子的實(shí)際發(fā)芽率。

實(shí)驗(yàn)根據(jù)采集的1200粒甜菜種子圖像建立了SVM-RBF發(fā)芽率預(yù)測(cè)模型，經(jīng)過(guò)近紅外光譜技術(shù)的5種不同預(yù)處理后得出的預(yù)測(cè)發(fā)芽率與發(fā)芽實(shí)驗(yàn)得出的實(shí)際發(fā)芽率進(jìn)行對(duì)比，從中選擇預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率最好的模型對(duì)甜菜種子的活力進(jìn)行預(yù)測(cè)。同時(shí)，為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性和泛化性能，從未參加實(shí)驗(yàn)的備用甜菜種子中隨機(jī)挑選出同品種、同大小的種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3.5 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 首先從備用甜菜種子中隨機(jī)選擇500粒，并對(duì)這500粒甜菜種子按順序標(biāo)號(hào)，依次進(jìn)行近紅外高光譜掃描，并采集高光譜圖像，再利用預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率最好的智能預(yù)測(cè)模型來(lái)對(duì)這500粒甜菜種子進(jìn)行活力預(yù)測(cè)[25]。將采集完高光譜圖像的甜菜種子按照上文所述的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)來(lái)獲取實(shí)際發(fā)芽率，再將甜菜種子的實(shí)際發(fā)芽狀態(tài)與模型的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型預(yù)測(cè)結(jié)果分析

利用所提取的甜菜種子光譜信息建立SVM-RBF發(fā)芽率預(yù)測(cè)模型，以經(jīng)過(guò)不同光譜預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)作為模型輸入，甜菜樣本所對(duì)應(yīng)的發(fā)芽狀態(tài)作為輸出，訓(xùn)練預(yù)測(cè)模型[26]。經(jīng)過(guò)參數(shù)調(diào)節(jié)與模型訓(xùn)練獲得最好性能模型，而此時(shí)最好SVM-RBF模型的懲罰參數(shù)為30，gamma參數(shù)為59，在此參數(shù)下可以得出不同預(yù)處理下SVM-RBF的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率如圖2所示。種子光譜經(jīng)過(guò)一階差分(1D)處理后預(yù)測(cè)性能最好，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到91.92%。甜菜種子光譜經(jīng)Savitzky-Golay平滑處理(SG)與二階差分(2D)處理后SVM-RBF的預(yù)測(cè)性能也較好，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率均在85%以上。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)與去趨勢(shì)校正(DET)處理的種子光譜SVMRBF的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率較低，并不能使模型獲得較高的預(yù)測(cè)性能。

圖2 不同預(yù)處理下的模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率

2.2 發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果分析

在本次實(shí)驗(yàn)中，發(fā)芽天數(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)種子活力的重要標(biāo)準(zhǔn)，在實(shí)驗(yàn)早期發(fā)芽的種子被認(rèn)為是具有高活力的種子，在實(shí)驗(yàn)周期后幾天發(fā)芽的種子被認(rèn)為是具有一般活力的種子，而在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)并沒(méi)有發(fā)芽的種子被認(rèn)為是不具有活力的[27]?；谶@個(gè)結(jié)論，可以將在發(fā)芽期間內(nèi)的種子被分為3種類型，在4天內(nèi)發(fā)芽的種子代表活力最旺盛的種子，在4～8天內(nèi)發(fā)芽的種子代表活力一般的種子，未發(fā)芽的種子代表無(wú)活力的種子。

從表1可以看出，老化2天后的甜菜種子發(fā)芽率最高，為60.16%；其次為老化4天的甜菜種子，發(fā)芽率為52.73%；最后為老化6天后的甜菜種子，發(fā)芽率為47.70%。而從種子活力的角度來(lái)看，老化2天后的甜菜種子活力要高于其他2種老化周期的種子活力，同時(shí)，隨著老化周期的延長(zhǎng)，種子的活力和發(fā)芽率都在減少；而高活力種子和存活種子的比例也在減少。

表1 發(fā)芽試驗(yàn)種子活力測(cè)定結(jié)果

2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)利用預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率最好的一階差分處理后智能預(yù)測(cè)模型來(lái)對(duì)這500粒甜菜種子進(jìn)行活力預(yù)測(cè)，得出的預(yù)測(cè)種子發(fā)芽率與發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中甜菜種子的實(shí)際發(fā)芽率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，模型預(yù)測(cè)的發(fā)芽種子總數(shù)為252，未發(fā)芽種子總數(shù)為248；發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中實(shí)際發(fā)芽種子總數(shù)為275，未發(fā)芽種子總數(shù)為225。根據(jù)式(6)可以得出一階差分處理后智能預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為88.2%，能夠較準(zhǔn)確地對(duì)甜菜種子發(fā)芽狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測(cè)。模型預(yù)測(cè)種子總數(shù)與實(shí)際發(fā)芽種子總數(shù)如表2所示。

表2 模型預(yù)測(cè)與發(fā)芽實(shí)驗(yàn)結(jié)果比對(duì)

3 結(jié)論

將模型預(yù)測(cè)的發(fā)芽率和實(shí)際發(fā)芽實(shí)驗(yàn)得出的發(fā)芽率進(jìn)行比對(duì)，可以得出近紅外光譜技術(shù)在預(yù)測(cè)甜菜種子的發(fā)芽率上有著較高的準(zhǔn)確率，能夠較準(zhǔn)確地區(qū)分發(fā)芽與未發(fā)芽的甜菜種子。從結(jié)果可以看出，通過(guò)近紅外光譜對(duì)甜菜樣品種子進(jìn)行掃描處理，得出近紅外高光譜圖像后，再綜合多種預(yù)處理方法建立的智能檢測(cè)模型是一種快速、便捷且無(wú)損于種子的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了種子活力的快速、有效鑒定。

4 討論

近紅外光譜技術(shù)作為一種快速測(cè)定種子活力的方法，可以顯著區(qū)分出種子活力的高低，提高作物育種的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前，近紅外光譜技術(shù)在檢測(cè)作物種子活力方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。楊東風(fēng)等[28]采用近紅外光譜構(gòu)建了6個(gè)模型對(duì)玉米的9個(gè)主成分進(jìn)行分析，但由于采用的預(yù)處理方法和特征提取方法不同，影響了識(shí)別的平均時(shí)間和準(zhǔn)確性，不便于分析。而在本實(shí)驗(yàn)中采取了5種光譜預(yù)處理方法，從不同角度消除高光譜圖像采集時(shí)外界干擾的影響，減小了處理方法不同對(duì)識(shí)別準(zhǔn)確性的影響；同時(shí)李晉華等[29]采集玉米的近紅外光譜，對(duì)玉米的4個(gè)主成分進(jìn)行了分析，但由于樣品裝樣方式的不同和采集的光譜速度慢等原因，得到的光譜信息量較低。而本次實(shí)驗(yàn)中基于模型的變化，用于選擇與種子發(fā)芽能力具有最佳變量，通過(guò)不同的預(yù)處理方法來(lái)選擇最佳變量，為獲得盡可能少的變量，每種方法都使用了更高的閾值來(lái)獲取更多的光譜信息來(lái)保證模型的準(zhǔn)確性[30-31]。

本實(shí)驗(yàn)在獲取種子高光譜圖像時(shí)，選擇的是最佳波長(zhǎng)范圍而不是整個(gè)光譜范圍，減小了外界干擾并獲取了更多的光譜信息，圖像獲取完后再基于標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換、去趨勢(shì)校正、Savitzky-Golay平滑處理、一階差分和二階差分等5種光譜預(yù)處理后建立的智能檢測(cè)模型[32]?？梢缘贸鲞@5種模型對(duì)甜菜種子的活力預(yù)測(cè)精度分別為75.77%、78.11%、85.17%、91.92%和88.25%，而一階差分預(yù)處理后建立的預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)性能是預(yù)處理方法中最好的。但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)于變量的選擇是不能控制的，變量越多其模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性會(huì)降低，因此對(duì)于擴(kuò)大不同預(yù)處理方法來(lái)選擇最佳變量，來(lái)獲取更準(zhǔn)確的模型。這不僅在學(xué)術(shù)領(lǐng)域有更高的價(jià)值，而且對(duì)于今后作物種子活力的預(yù)測(cè)提供更為精準(zhǔn)的方法。