昝珂，周穎，鄭成

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.浙江省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點(diǎn)實驗室，杭州 310052）

魚腥草芩藍(lán)合劑為常見中藥制劑，由魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花5 味中藥材配制而成，具有清熱解毒的作用，臨床常用于治療外感風(fēng)熱引起的咽喉腫痛，急性咽炎、扁桃體炎等疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，該制劑具有良好的解熱作用，臨床治療小兒皰疹性咽峽炎有較好的療效［1-4］。魚腥草芩藍(lán)合劑收錄于國家藥品監(jiān)督管理局國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)中，然而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中只有魚腥草、黃芩、連翹和金銀花的薄層色譜鑒別項和黃芩苷含量的測定項［5］，不能全面地反映復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量。目前有關(guān)該制劑組分含量的測定研究較少，鄧茂芳等［6］建立了高效液相色譜（HPLC）法同時測定魚腥草芩藍(lán)合劑中綠原酸、黃芩苷和黃芩素含量的方法。魚腥草芩藍(lán)口服液是同方配制的獸藥制劑［7］，陸安等［8］以魚腥草芩藍(lán)口服液為研究對象，建立了HPLC 指紋圖譜鑒別方法，但未進(jìn)行含量測定研究；邢玉娟等［9］建立了HPLC 法測定魚腥草芩藍(lán)口服液中黃芩苷和綠原酸含量的方法。魚腥草中含有綠原酸、槲皮素、槲皮苷等化學(xué)成分［10-11］；黃芩中含有黃芩苷、漢黃芩素和漢黃芩苷等成分［12-13］；連翹中含有綠原酸、槲皮素、槲皮苷、連翹酯苷A 等成分［14-15］；金銀花中含有綠原酸、槲皮素和槲皮苷等成分［16-17］。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，對試驗條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了HPLC 法同時測定魚腥草芩藍(lán)合劑中綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素7 種成分含量的方法，為全面控制該制劑的質(zhì)量提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Ultimate U3000 型，配有Chromeleon 7.2SR5 色譜工作站、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

電子天平：XPE205 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超聲波提取器：ELMA SONIC P 型，德國艾爾瑪公司。

純水儀：Milli PAK advantage A10 型，美國密理博公司。

復(fù)方魚腥草合劑樣品：某生產(chǎn)企業(yè)樣品。

綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素、漢黃芩素對照品：批號分別為18071907、A19011704、18041002、19091104、18032111、19082203、18030509，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別 為96.1%、97.2%、93.3%、100.0%、98.5%、98.8%、99.1%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

乙腈、甲醇：均為色譜純，美國賽默飛世爾公司。

磷酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（北京）有限公司。

實驗用水為超純水。

1.2 溶劑配制

對照品單標(biāo)儲備液：分別精密稱取綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素對照品各約10 mg，其中黃芩苷置于10 mL 容量瓶中，其它6 種化合物分別置于100 mL 容量瓶中，各加入50%甲醇溶液溶解，稀釋，定容至標(biāo)線，配制成綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素的質(zhì)量濃度分別為98.5、102.4、994、97.8、101.2、98.8、103.2 μg／mL 的 單 標(biāo)儲備液。

混合對照品溶液：分別精密量取上述對照品單標(biāo)儲備液各1 mL，置于同一只10 mL 容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素、漢黃芩素的質(zhì)量濃度分別為9.85、10.24、99.4、9.78、10.12、9.88、10.32 μg／mL 的混合對照品溶液。

1.3 樣品處理

精密量取魚腥草芩藍(lán)合劑2 mL，置于20 mL棕色容量瓶中，加入50%甲醇溶液12 mL，超聲20 min，冷卻至室溫，用50%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，待測。

1.4 色譜條件

色 譜 柱：Symmetry Shield RP18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國沃特世公司)；流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：初始乙腈體積分?jǐn)?shù)為20%，0～30 min，乙腈由20%逐漸增加至40%，保持30 min，60～80 min，乙腈由40%逐漸增加至80%；流量：1.0 mL／min；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長選擇

所測7 種化合物中，綠原酸為咖啡酰奎寧酸類，紫外光譜最大吸收峰為327 nm；連翹酯苷A 為苯乙醇苷類，最大吸收為330 nm；其余成分為黃酮或黃酮苷類，黃芩苷最大吸收波長為278 nm，槲皮苷為254 nm 和350 nm，漢黃芩苷為276 nm，槲皮素為370 nm，漢黃芩素為276 nm。各成分之間紫外最大吸收波長差別較大，但在210 nm 處均有較強(qiáng)的紫外吸收，故選擇210 nm 作為檢測波長同時檢測7種成分。

2.2 色譜條件優(yōu)化

分別選擇乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相，考察不同流動相體系對7 種待測成分的分離效果。結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相時，色譜峰形較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相。由于7 種待測化合物極性跨度較大，采用等度洗脫無法對所有化合物進(jìn)行分離，故采用梯度洗脫方式。對梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，最終確定洗脫程序：初始乙腈體積分?jǐn)?shù)為20%，0～30 min，乙腈由20%逐漸增加至40%，保持30 min，60～80 min，乙腈由40%逐漸增加至80%。在此洗脫程序下，7 種化合物在80 min 內(nèi)獲得較好的分離，峰形較好。

2.3 色譜柱選擇

分別對SymmetryShield RP18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse XDB 柱（250×4.6 mm，5 μm）和ODS HHPERSIL 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) 3 種型號的色譜柱進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SymmetryShield RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱分離效果最佳，故選擇該色譜柱進(jìn)行方法學(xué)考察和樣品測定。

2.4 樣品提取條件選擇

樣品為口服液體制劑，溶解性較好，但個別化合物濃度較高，故采用50%甲醇對樣品制劑稀釋10 倍，過濾后直接進(jìn)樣測定。混合對照品溶液和樣品溶液色譜圖如圖1 所示。

圖1 混合對照品溶液和樣品溶液色譜圖

2.5 線性方程與檢出限

精密吸取1.2 中的混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按1.4 色譜條件分別進(jìn)樣測定，以待測化合物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

將1.2 中的混合對照品溶液用50%甲醇溶液逐級稀釋，在1.4 色譜條件下測定，以3 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限，以10 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限。7 種待測成分的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表1。

表1 7 種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

由表1 可知，7 種待測化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法的檢出限和定量限均滿足魚腥草芩藍(lán)合劑中7 種化合物的檢測需要。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取魚腥草芩藍(lán)合劑樣品，按照1.3 樣品處理方法制備樣品溶液，分別在配制完成后第1、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測定各待測化合物的色譜峰面積。綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.78%、0.81 %、0.74%、0.93%、1.21 %、1.01%、1.22%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 精密度試驗

取魚腥草芩藍(lán)合劑樣品，按1.3 方法平行制備6份樣品溶液，在1.4 色譜條件下分別進(jìn)樣測定，計算綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果

由表2 可知，綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.23%～1.76%，表明該方法精密度較好，滿足測定要求。

2.8 加標(biāo)回收試驗

精密量取6 份魚腥草芩藍(lán)合劑樣品各1 mL，分別精密加入綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素單標(biāo)儲備液各1.0、1.0、2.0、0.2、5.0、0.2、0.5 mL，按照1.3 樣品處理方法制備加標(biāo)樣品溶液，在1.4 色譜條件下分別進(jìn)樣測定，計算樣品加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

由表3 可知，樣品加標(biāo)平均回收率為在98.17%～101.48%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜法同時測定魚腥草芩藍(lán)合劑中綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、槲皮苷、漢黃芩苷、槲皮素和漢黃芩素含量的方法。所測7 種成分涉及4 種藥材中的活性成分，涵蓋了多類指標(biāo)成分，包括2 種苯丙素和5 種黃酮，為魚腥草芩藍(lán)合劑的質(zhì)量控制提供了參考方法。