譚麗盈

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510400）

延胡索為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖，夏初莖葉枯萎時(shí)采挖，除去須根，洗凈，置沸水中煮或蒸至恰無白心時(shí)，取出，曬開，具有活血止痛、行氣的功效，主要用于治療胸痹心痛、脘腹疼痛等疾?。?-2］，處方中常用醋制。延胡索藥材在干燥和運(yùn)輸過程中易于產(chǎn)生霉變，霉菌容易產(chǎn)生真菌毒素，真菌毒素是一類繁殖能力和毒性極強(qiáng)的物質(zhì)，如果人體感染真菌毒素，會(huì)引起皮膚類變質(zhì)或者白細(xì)胞數(shù)量變化，導(dǎo)致血凝時(shí)間長(zhǎng)，甚至引起死亡［3-4］。真菌毒素中的主要代表是黃曲霉毒素，黃曲霉毒素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的二氫呋喃香豆素的衍生物［5-6］，主要包括黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）及其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2。黃曲霉毒素在致癌目錄中居于首位，是目前已知的最強(qiáng)致癌物之一［7］，可誘發(fā)肝癌、胃癌、腎癌、直腸癌等，還可出現(xiàn)畸胎，具有確切的“三致”毒性［8］。黃曲霉毒素B1的半數(shù)致死量為0.36 mg／kg，屬于劇毒物質(zhì)范圍，且主要存在于陳皮、薏苡仁、地龍、延胡索等中藥材中。

目前對(duì)延胡索的研究主要集中在化學(xué)成分分析、質(zhì)量控制和安全性評(píng)價(jià)等方面［9-11］。黃曲霉毒素屬于藥品安全性控制指標(biāo)，因此測(cè)定延胡索藥材中的黃曲霉毒素具有重要意義。目前檢測(cè)黃曲霉毒素的方法主要有薄層色譜法［12］、高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法［13］、高效液相色譜免疫親和柱-熒光分光光度法［14］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）法以及Elisa 快篩法［15-16］等。薄層色譜法操作簡(jiǎn)單，但是只能用于定性且靈敏度低；高效液相色譜-光化學(xué)衍生法和高效液相色譜-熒光法雖然可以定量，但是由于中藥材基質(zhì)復(fù)雜，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）法采用多反應(yīng)檢測(cè)方式，可以快速測(cè)定黃曲霉毒素，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，同時(shí)可以避免假陽性結(jié)果。筆者以70%甲醇溶液為提取劑，采用Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱分離，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）法同時(shí)測(cè)定醋延胡索藥材中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2含量的方法。該方法靈敏度高，重復(fù)性好，可用于大批量樣品的同時(shí)測(cè)定，滿足延胡索中黃曲霉毒素檢測(cè)的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：Waters H-class XEVO TQD 型，MassLynx V4.1 工作站，美國(guó)waters 公司。

電子分析天平：Sartorius BT124S 型，感量為0.1 mg，北京賽多利斯儀器有限公司。

超聲波清洗器：KQ-700VDB 型，昆山市超聲儀器有限公司。

免疫親和柱：Pribo Fast IAC，青島普瑞邦生物科技有限公司。

低速臺(tái)式離心機(jī)：An Ke TDL-60B 型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

超純水機(jī)：Milli-Q Reference型，美國(guó)默克公司。

氮?dú)獍l(fā)生器：Genius-NM32LA 型，英國(guó)匹克科技公司。

黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2質(zhì)量濃度分別為1.04、0.35、1.18、0.59 μg／mL，批號(hào)為610001-201301，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

AFB1質(zhì)控樣品：編號(hào)為CFAPA-QC522B-1，參考值為（2.95±0.88） μg／kg，大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司。

AFB2質(zhì)控樣品：編號(hào)為CFAPA-QC522B-2，參考值為（1.96±0.67） μg／kg，大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司。

AFG1質(zhì)控樣品：編號(hào)為CFAPA-QC522B-3，參考值為（2.35±0.71） μg／kg，大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司。

AFG2質(zhì)控樣品：編號(hào)為CFAPA-CFAPAQC522B-4，參考值為（2.13±0.80） μg／kg，大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司。

玻璃纖維濾紙：青島普瑞邦公司。

氯化鈉：分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司。

甲醇：色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

其它試劑均為分析純。

醋延胡索樣品：共10 批，均為罌粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的干燥塊莖，且均為醋制品，基本信息見表1。

表1 醋延胡索樣品基本信息

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜

色譜柱：Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)沃特世公司）；流動(dòng)相：甲醇（A）-10 mmol 醋酸銨溶液（B）；梯度洗脫程序：初始B 的體積分?jǐn)?shù)為36%，0～5 min 時(shí)，B 由36%逐漸增加至85%，5～6.5 min 時(shí)，B 由85%逐漸增加至100%，6.5～6.6 min時(shí)，B 為36%；流量：0.3 mL／min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

1.2.2 質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子模式采集；檢測(cè)方式：MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）方式；毛細(xì)管電壓：0.5 kV；錐孔電壓：55 V；離子源溫度：150 ℃；去溶劑氣：氮?dú)?，流量?50 L／h，溫度為450 ℃。4 種黃曲霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 4 種黃曲霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 對(duì)照品溶液制備

黃曲霉毒素對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的質(zhì)量濃度分別為10.4、3.5、11.8、5.9 ng／mL，精密吸取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL，置于10 mL 容量瓶中，加入70%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻。

黃曲霉毒素對(duì)照品系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：將上述黃曲霉毒素對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用70%甲醇溶液逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的質(zhì)量濃度見表3。

表3 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度 ng／mL

1.4 供試品溶液制備

取批號(hào)為Y1369111 的醋延胡索樣品，粉碎，過二號(hào)篩，精密稱取醋延胡索粉末15 g，置于均質(zhì)瓶中，加入3 g 氯化鈉和70%甲醇溶液50 mL，攪拌3 min（攪拌速度大于10 000 r／min），以3 000 r／min轉(zhuǎn)速離心5 min。取上清液10 mL，置于50 mL 容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，用0.45 μm 玻璃纖維濾紙濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液20 mL，通過免疫親和柱（溫度為25 ℃），用20 mL 水洗脫，棄去洗脫液，用空氣除去殘留在柱中的水分，再用3 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液，置入蒸發(fā)皿中，氮?dú)獯蹈?，然后用甲醇溶解并定容? mL 容量瓶中，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 供試品溶液制備條件選擇

采用選擇性較高的免疫親和柱，可以吸附黃曲霉毒素使雜質(zhì)通過柱子，從而使樣品得以純化，然后利用黃曲霉毒素能溶于甲醇的性質(zhì)將其進(jìn)行洗脫，免疫親和柱將提取、凈化、濃縮一次完成，具有操作簡(jiǎn)單、凈化效果好，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和效率。在供試品溶液制備過程中，當(dāng)樣品溶液通過免疫親和柱時(shí)，要靠重力作用使樣品溶液緩慢通過免疫親和柱，使樣品溶液中的抗原和免疫親和柱中抗體有充分的反應(yīng)時(shí)間，保證黃曲霉毒素被柱子吸附。在用水洗完之后，用空氣除去殘留在柱中的水分，使黃曲霉毒素得以全部洗脫，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于免疫親合柱上酶的活性與溫度有關(guān)，因此在供試品溶液制備過程中室內(nèi)溫度會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。當(dāng)室溫為18 ℃時(shí)，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的回收率分別為35%、27%、38、和29%；當(dāng)室溫為21 ℃時(shí)，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的回收率分別為62%、49%、77、和53%；當(dāng)室溫為25 ℃時(shí)，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的回收率分別為82%、75%、96%、和83%，此時(shí)回收率符合方法學(xué)的要求；當(dāng)室內(nèi)溫度為29 ℃時(shí)，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的回收率分別為53%、41%、62%、和49%，這是由于溫度較高，免疫親合柱中酶的活性降低，導(dǎo)致柱子吸附黃曲霉毒素能力減弱所致，因此選擇室溫25 ℃制備供試品溶液。

2.2 色譜條件優(yōu)化

分別選擇乙腈-水溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-10 mmol 醋酸銨溶液作為流動(dòng)相，考察不同流動(dòng)相體系對(duì)目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈的洗脫能力較強(qiáng)，出峰較快，色譜分離效果差；醋酸銨的離子響應(yīng)優(yōu)于甲酸，因此選擇甲醇-醋酸銨作為流動(dòng)相。

以1.3 中的3＃黃曲霉毒素對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為測(cè)定對(duì)象，分別選擇柱溫為30、35、40、45 ℃，考察不同柱溫對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，柱溫高，峰形好，并且柱溫高，出峰快，當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí)，4 種黃曲霉毒素的分離效果最好，綜合考慮選擇柱溫為40℃。

以1.3 中的3＃黃曲霉毒素對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為測(cè)定對(duì)象，分別選擇進(jìn)樣體積為1、2、5 μL，考察不同進(jìn)樣體積對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)樣體積為1 μL 時(shí)，色譜峰形較差，響應(yīng)低，色譜峰面積??；當(dāng)進(jìn)樣體積為2 μL 時(shí)，色譜峰形對(duì)稱，分離度較好；當(dāng)進(jìn)樣體積為5 μL 時(shí)，色譜峰形裂分，出現(xiàn)平頭峰，因此選擇進(jìn)樣體積為2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

首先采用全掃描的方式對(duì)4 種黃曲霉毒素的母離子進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 種黃曲霉毒素在正離子模式下［M+H］+的響應(yīng)值較高；然后對(duì)毛細(xì)管電壓和錐孔電壓進(jìn)行優(yōu)化，選取響應(yīng)較高的毛細(xì)管電壓和錐孔電壓；通過調(diào)整碰撞電壓分別對(duì)4 種黃曲霉毒素的子離子進(jìn)行優(yōu)化，選取響應(yīng)最強(qiáng)的兩個(gè)子離子分別作為定量和定性離子，優(yōu)化結(jié)果見1.2.2。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別取醋延胡索陽性樣品和陰性樣品，按照1.4方法制備供試品溶液，在1.2 儀器工作條件下分別進(jìn)行測(cè)定。黃曲霉毒素對(duì)照品混合溶液、醋延胡索陽性樣品及陰性樣品色譜圖分別如圖1、圖2、圖3所示。由圖2 和圖3 可以看出，延胡索樣品中其它成分不干擾黃曲霉毒素的測(cè)定。

圖1 黃曲霉毒素對(duì)照品混合溶液色譜圖

圖2 醋延胡索陽性樣品色譜圖

圖3 醋延胡索陰性樣品色譜圖

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取15 g 批號(hào)為Y1369111 的醋延胡索樣品，加入1 mL 黃曲霉毒素對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 儀器工作條件下，分別在制備完成后第0、1、2、4、8、12、16、20、24 h 測(cè)定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2色譜峰面積，結(jié)果見表4。由表4 可知，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2定量離子色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.73%、3.54%、1.13%和1.22%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 線性方程與檢出限

在1.2 儀器工作條件下，對(duì)1.3 中的黃曲霉毒素對(duì)照品系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)，定量離子的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。對(duì)1＃黃曲霉毒素對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度分別計(jì)算AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的檢出限。4 種黃曲霉毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表5。

表5 4 種黃曲霉毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.6 精密度試驗(yàn)

精密稱取6 份批號(hào)為Y1369111 的醋延胡索樣品各15 g，分別加入黃曲霉毒素對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，按照1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 儀器工作條件下分別測(cè)定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2色譜峰面積，結(jié)果見表6。由表6 可知，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.26%、2.79%、0.84%和1.33%，表明該方法的精密度良好。

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

選取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2質(zhì)控樣品，按照1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表7。

表7 質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果 μg／kg

由表7 可知，測(cè)定值均在參考值不確定度范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取批號(hào)為Y1369111 的醋延胡索樣品，平行稱取9 份，每份7.5 g，每3 份為一組，分別加入低、中、高3 種濃度的黃曲霉毒素對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2＃、3＃和4＃溶液）各1 mL，按照1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的回收率，結(jié)果見表8。由表8 可知，樣品加標(biāo)平均回收率分別為88.94%、76.82%、104.90%和93.22%，表明該方準(zhǔn)確度良好。

表8 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

選取10 批醋延胡索樣品，按照1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 儀器工作條件下分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表9。由表9 可知，10 批樣品中均檢出AFB1，其它3 種黃曲霉毒素均未檢出。10 批樣品中的AFB1含量均未超出《中國(guó)藥典》2020 年版一部中藥材中AFB1含量不大于5 μg／kg 的限量規(guī)定。

表9 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定醋延胡索藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法。該方法靈敏度高，檢測(cè)速度快，同時(shí)避免了假陽性結(jié)果，可用于多批次樣品的快速測(cè)定，從而保證臨床用藥的安全性。用所建方法測(cè)定不同廠家10 批次的醋制延胡索樣品，均檢出黃曲霉毒素B1，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)醋延胡索藥材中黃曲霉毒素的監(jiān)測(cè)。