華正罡，陳曦，馮靜

（遼寧省疾病預(yù)防控制中心，遼寧省空氣霧霾與人群健康監(jiān)測重點實驗室，沈陽 110005）

雷公藤，別名黃藤根、斷腸草、旱禾花（《湖南藥物志》）、黃藤木（《廣西藥植名錄》）、黃藤草（《江西草藥手冊》）［1］等，是傳統(tǒng)的中藥材。近年來，對雷公藤的基礎(chǔ)研究主要集中在雷公藤多苷、雷公藤甲素等雷公藤的制劑［2］。雷公藤多苷是從雷公藤根中提取精制而成的一種脂溶性混合物，為我國首先研究利用的抗炎免疫調(diào)節(jié)中草藥，具有“中草藥激素”之稱［3］。臨床上可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性腎小球腎病、腎病綜合征、紫瘢性及狼瘡性腎炎、紅斑狼瘡、亞急性及慢性重癥肝炎、慢性活動性肝炎等免疫系統(tǒng)疾?。?-6］。但是由于雷公藤中的主要有效成分亦為毒性成分，特別是皮部（包括二重皮）毒性較大，超量內(nèi)服或食入雷公藤嫩芽，或因炮制不當(dāng)（根皮未剝、原液汁未洗凈）等，均可導(dǎo)致人體中毒，甚至死亡［7］。雷公藤中毒癥狀主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、乏力及黑便，嚴(yán)重的會損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)［8-10］。通過對雷公藤毒性、中毒機理及毒性成分進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，引起雷公藤中毒的主要成分是二萜內(nèi)酯類，其次為生物堿類，主要包括雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤晉堿及雷公藤次堿［11］。

目前國內(nèi)外針對雷公藤中毒與毒性成分的研究主要集中在雷公藤藥材中各成分的檢測［12-13］，以及分析雷公藤中活性成分新的藥效研究［14］。常用的分析方法主要有比色法［15］、高效液相色譜法［16］。上述方法主要用于雷公藤藥材及制劑中各成分的測定，但用于雷公藤中毒者嘔吐物、血液、尿液等中毒樣品的測定則存在檢測時間長、檢測靈敏度低等缺點。鐘世豪［17］采用QuEChERS-HPLC-MS／MS 法對生物樣品如血液、肝臟、尿液中包括雷公藤吉堿、雷公藤次堿、雷公藤春堿、雷公藤定堿等在內(nèi)的24種植物毒素進(jìn)行了測定，但因樣品性質(zhì)不同，此方法不適用于中毒者嘔吐物的測定。筆者針對雷公藤急性中毒者的嘔吐物，建立一種快速、準(zhǔn)確的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，對中毒患者搶救及中毒案件分析具有理論和現(xiàn)實意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquity Xevo TQ 型，美國沃特世公司。

高速冷凍離心機：Thermo ST16R 型，美國賽默飛世爾科技公司。

漩渦混合器：Vortex-genie2 型，美國Scientific industries 公司。

分析天平：BS 110S 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。

雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均不小于98%，批號分別為20113、20625、20209、20907，南通飛宇生物科技有限公司。

雷公藤中毒者胃內(nèi)容物凍干粉樣品：簡稱凍干粉樣品，編號為ZW 054，由中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所提供。

胃內(nèi)容物凍干粉陰性樣品：編號為ZW051，簡稱凍干粉陰性樣品，由中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所提供。

乙腈、甲醇：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

甲酸銨、甲酸：均為優(yōu)級純，北京化工廠。實驗用水為超純水。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲標(biāo)準(zhǔn)品各（2.5±0.1）mg，分別置于4 只10 mL 容量瓶中，分別加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線，配制成雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)量濃度分別為0.240 0、0.260 0、0.255 0、0.249 6 mg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確吸取上述雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲標(biāo)準(zhǔn)儲備液各0.2 mL，分別置于4 只10 mL 容量瓶中，分別加入甲醇稀釋定容至標(biāo)線，配制成雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)量濃度分別為4.8、5.2、5.1、5.0 μg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于-20 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：依次準(zhǔn)確吸取雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲標(biāo)準(zhǔn)中間液1.0、1.0、1.0、2.0 mL，置于同一只10 mL 容量瓶中，加入10%甲醇-0.1%甲酸溶液定容至標(biāo)線，配制成雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)量濃度分別為0.48、0.52、0.51、1.0 μg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-20 ℃保存。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：依次準(zhǔn)確吸取雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，分別置于5 只1 mL 容量瓶中，分別加入10%甲醇-0.1%甲酸溶液定容至標(biāo)線，配制成雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20℃避光保存。系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)量濃度見表1。

表1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度 ng／mL

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜

色 譜 柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，粒徑為1.7 μm，美國沃特世公司）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流動相：A 相為乙腈；B 相為10 mmol／L 甲酸銨-0.1%甲酸溶液；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：初始A 相體積分?jǐn)?shù)為5%，0～3 min，A 相體積分?jǐn)?shù)由5%逐漸上升至95%并保持至第7 min，7.01 min 開始A 相體積分?jǐn)?shù)降回5%并保持至第8 min；流量：0.3 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.2 串聯(lián)質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描模式；毛細(xì)管電壓：2.64 kV；離子源溫度：150 ℃；錐孔反吹氣：氮氣，純度（體積分?jǐn)?shù)）大于99.999%，流量為50 L／h；脫溶劑氣：氮氣，溫度為350 ℃，流量為650 L／h；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。4 種毒性化合物質(zhì)譜參數(shù)及保留時間見表2。

表2 4 種毒性化合物的質(zhì)譜參數(shù)及保留時間

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確至0.001 g）凍干粉樣品，置于15 mL 離心管中，加入10 mL 甲醇，超聲提取60 min，以10 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液與水按體積比為1∶1 稀釋，過0.22 μm 濾膜后進(jìn)樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱選擇

4 種待測物均為脂溶性化合物，適用于反相色譜柱對其進(jìn)行分離檢測，分別考察耐100%水相、對極性基質(zhì)干擾有較好分離效果的Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱和對中等極性和弱極性化合物均有較好保留的通用型Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱對4 種待測化合物的分離效果。結(jié)果顯示，兩種色譜柱均能實現(xiàn)對待測化合物的保留，但BEH C18柱保留時間更為適宜，尤其是針對雷公藤內(nèi)酯甲，可將出峰時間提前3 min，單個樣品測定時間縮短至8 min，因此選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱作為樣品分析柱。

2.2 流動相選擇

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀常用的有機相一般為甲醇或者乙腈，當(dāng)待測物的靈敏度極低時，以甲醇和乙腈的混合液作為有機相，可以提高待測物響應(yīng)值。針對雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲的測定，分別考察了甲醇和乙腈作為有機相時的測定結(jié)果，表明乙腈作為有機相時本底值更低，待測物的靈敏度更高，同時乙腈作為有機相洗脫能力強于甲醇，可以進(jìn)一步縮短檢測時間，因此選擇乙腈作為有機相。

在對待測物質(zhì)譜條件優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，正離子監(jiān)測模式下，雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲能夠同時監(jiān)測到（M+NH4+）峰和（M+H+）峰兩個母離子，且（M+NH4+）峰的靈敏度遠(yuǎn)高于（M+H+）峰，因此選擇以雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲的（M+NH4+）峰作為母離子。為了確保（M+NH4+）峰母離子響應(yīng)值的穩(wěn)定輸出，水相中需添加一定量的甲酸銨和甲酸以提供穩(wěn)定的銨離子（-NH4+）和氫離子（-H+）環(huán)境，經(jīng)考察對比，最終確定以10 mmol／L 甲酸銨-0.1%甲酸溶液作為水相可得到最佳的色譜峰形及響應(yīng)值。4 種毒性化合物典型色譜圖如圖1 所示。

圖1 4 種毒性化合物典型色譜圖

2.3 提取方法選擇

目前對雷公藤藥材中脂溶性成分測定時，提取方式多采用甲醇超聲提取后經(jīng)固相萃取柱凈化，氮吹濃縮后以高效液相色譜儀測定。此方法步驟復(fù)雜耗時，不能滿足中毒樣品快速測定的要求，同時雷公藤內(nèi)酯甲的穩(wěn)定性不佳，氮吹濃縮過程中容易造成損失，影響測定結(jié)果。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的靈敏度遠(yuǎn)高于液相色譜儀，通過對提取凈化液進(jìn)行稀釋，降低基質(zhì)效應(yīng)和溶劑效應(yīng)，然后直接進(jìn)樣測定，有助于減少提取過程中待測物質(zhì)的損失。以空白溶劑加標(biāo)樣品為測定對象，用甲醇超聲提取、凈化后，分別考察提取凈化液經(jīng)氮吹濃縮后測定和用水按體積比1∶1 稀釋后直接測定兩種方法的回收率，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可以看出，4 種待測物在40 ℃下經(jīng)氮氣吹干后均造成了不同程度的損失，其中對雷公藤內(nèi)酯甲損失最大，回收率降至0。對提取凈化液稀釋后直接進(jìn)樣測定，可以減少提取過程中待測物質(zhì)的損失，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

圖2 不同提取方法時的回收率

2.4 提取時間選擇

稱取凍干粉樣品0.05 g(精確至0.001 g），以10 mL 甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，控制超聲儀內(nèi)水溫不超過25 ℃，對比不同提取時間時4 種待測化合物的測定結(jié)果，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同提取時間時的測定結(jié)果

由圖3 可以看出，隨著超聲提取時間的延長，4種待測物的測定值逐漸增加，當(dāng)超聲提取時間為60 min 時，測定結(jié)果達(dá)到最大值，超聲時間超過60 min后，測定結(jié)果略有下降。綜合考慮，選擇超聲提取時間為60 min。

2.4 線性方程與檢出限

在1.3 儀器工作條件下，對1.2 中的雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定，以待測化合物的質(zhì)量濃度為X軸，以色譜峰面積為Y軸，進(jìn)行回歸分析，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以3 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限。4 種毒性化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表3。由表3 可知，4 種毒性化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

表3 4 種毒性化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗

準(zhǔn)確稱取6 份凍干粉陰性樣品各0.1 g，分別加入雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲標(biāo)準(zhǔn)儲備液各25 μL，按1.4 方法處理樣品，在1.3 儀器工作條件下分別進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果

由表4 可知，4 種毒性化合物的平均回收率為83.7%～95.3%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.66%～5.71%，表明該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。陰性樣品加標(biāo)色譜圖如圖4 所示。

圖4 陰性樣品加標(biāo)色譜圖

3 結(jié)語

對急性中毒者胃內(nèi)容物中4 種毒性成分的測定方法進(jìn)行了探索，相比于雷公藤藥材中脂溶性成分復(fù)雜的前處理過程，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的高靈敏性，對樣品采用甲醇超聲提取，稀釋后直接上機測定的分析方法，有效縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度。該方法對于其它類中毒樣品檢測方法的建立具有重要的參考意義。