許有誠(chéng)，趙莊，李丹鳳

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，南寧 530021）

復(fù)方丹參膠囊是由丹參、三七、冰片三味藥材配制而成的中藥復(fù)方制劑，具有活血化瘀、理氣止痛等功效，常用于治療冠心病、胸悶、心悸、心絞痛等疾病［1-2］。丹參和三七配伍使用，能使活血散瘀、通經(jīng)止痛之功效倍增，且兩者均含有氨基酸成分［3］。丹參為君藥，是唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神、抗腫瘤、抗菌、抗炎等功效［4］。丹參中氨基酸的成分主要有天門冬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸，總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.6%［5］。三七為臣藥，主要為五加科植物三七的干燥根，具有止血、補(bǔ)血、活血、抗炎消腫、保肝利膽等藥理作用［6-7］。三七中氨基酸的成分主要有精氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸，不同產(chǎn)地三七的氨基酸含量不同［8-9］。

氨基酸是生命代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物體內(nèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)生物大分子的活性及其生理功能起著極為重要的作用［10］。目前氨基酸的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法［11-13］、毛細(xì)管電泳法［14-15］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［16］。大部分氨基酸在紫外檢測(cè)區(qū)沒(méi)有吸收，如果采用高效液相色譜法對(duì)其測(cè)定，需要對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生化處理，導(dǎo)致成本高、操作復(fù)雜，且分析時(shí)間長(zhǎng)。毛細(xì)管電泳法可以采用間接紫外法，利用紫外吸收值較大的緩沖體系進(jìn)行分析，根據(jù)吸收值的差異使氨基酸成分產(chǎn)生倒峰從而達(dá)到定量的目的，但是該方法重現(xiàn)性較差，且線性范圍比較窄。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法采用離子對(duì)定量模式，可在多通道同時(shí)檢測(cè)多個(gè)氨基酸，但是由于氨基酸的性質(zhì)相近，在普通的液相色譜柱中很難得到有效分離，且異亮氨酸與亮氨酸等屬于同分異構(gòu)體成分，它們的母離子和子離子完全相同，質(zhì)譜無(wú)法進(jìn)行分離。筆者以鄰苯二甲醛（OPA）和9-芴甲氧羰酰氯（FMOC）為衍生試劑，分別對(duì)一級(jí)氨基酸和二級(jí)氨基酸進(jìn)行衍生化，不需要加熱就能生成具有紫外吸收的衍生物，解決了氨基酸無(wú)紫外吸收而無(wú)法定量的問(wèn)題，同時(shí)結(jié)合在線衍生技術(shù)，所有衍生步驟均由儀器自動(dòng)完成，避免了人工衍生化過(guò)程帶來(lái)的操作誤差，在此基礎(chǔ)上建立了同時(shí)測(cè)定復(fù)方丹參膠囊中19 種氨基酸含量的高效液相色譜法，該方法操作簡(jiǎn)單，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，為復(fù)方丹參膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究和應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電子分析天平：XD205DU 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

高效液相色譜儀：Agilent 1260 型，配有DAD檢測(cè)器、ChemStation 工作站，美國(guó)安捷倫科技公司。

超聲波清洗器：CQX25-06 型，頻率為45 kHz，上海超聲波儀器廠。

溶出度及自動(dòng)取樣系統(tǒng)：EDT-14Lx 型，印度Electrolab 公司。

衍生試劑：鄰苯二甲醛（OPA），批號(hào)為5061-3335，質(zhì) 量 濃 度 為10 mg／mL；9- 芴 甲 氧 羰 酰氯（FMOC），批 號(hào) 為5061-3337，質(zhì) 量 濃 度 為10 mg／mL，美國(guó)安捷倫科技公司。

硼酸鹽緩沖液：pH 值為8.2，批號(hào)為5061-3339，質(zhì)量濃度為12.37 g／L，美國(guó)安捷倫科技公司。

甲醇、乙腈：均為色譜純，德國(guó)默克公司。

磷酸氫二鈉、硼酸鈉：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

復(fù)方丹參膠囊樣品：共10 批，編號(hào)分別為1?！?0＃，市售。

19 種氨基酸對(duì)照品：基本信息見(jiàn)表1。

表1 19 種氨基酸對(duì)照品基本信息

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent HPH-C18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm，美國(guó)安捷倫科技公司）；流動(dòng)相：A 為10 mmol／L 硼酸鈉-磷酸氫二鈉緩沖液混合溶液（用6 mol／L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至8.2），B 為乙腈-甲醇-水（體積比為41∶41∶18）溶液；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～2 min，B 的體積分?jǐn)?shù)為5%；2～25 min，B 的體積分?jǐn)?shù)由5%逐漸增加至43%；25～26 min，B 的體積分?jǐn)?shù)由43%逐漸增加至100%，保持3 min；29～30 min，B 的體積分?jǐn)?shù)由100%逐漸降至5%，保持5 min；流量：1.0 mL／min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm（當(dāng)賴氨酸出峰后將波長(zhǎng)切換成262 nm）；進(jìn)樣體積：1 μL。

1.3 在線衍生程序

自動(dòng)進(jìn)樣器吸取1.0 μL 樣品溶液和2.5 μL硼酸鹽緩沖液，于清潔口混合6 次；等待0.5 min，精密加入0.4 μL OPA 衍生試劑混合10 次，然后再加入0.2 μL FMOC 衍生試劑混合10 次，最后精密加入32 μL 稀釋液（由200 mL 流動(dòng)相A 和0.8 mL濃H3PO4混合而成）混合10 次后進(jìn)樣測(cè)定。

1.4 溶液配制

19 種氨基酸混合對(duì)照品溶液：分別精密稱取19 種氨基酸對(duì)照品各約10 mg，置于同一100 mL容量瓶中，加入0.1 mol／L 鹽酸溶液溶解并稀釋至標(biāo)線，混勻，配制成19 種氨基酸的質(zhì)量濃度均約為100 μg／mL 的混合對(duì)照品溶液。

19 種氨基酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密吸取19 種氨基酸混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分別置于7 只10 mL 容量瓶中，用0.1 mol／L 鹽酸溶液定容至標(biāo)線，混勻，配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中19種氨基酸的質(zhì)量濃度見(jiàn)表2。

表2 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中19 種氨基酸的質(zhì)量濃度μg／mL

供試品溶液：取復(fù)方丹參膠囊20 粒，將內(nèi)容物傾出，混勻，研磨成細(xì)粉，精密稱取細(xì)粉1.0 g，置于25 mL 容量瓶中，加入0.1 mol／L 鹽酸溶液適量，超聲20 min 使其溶解，冷卻至室溫后用0.1 mol／L鹽酸溶液定容至標(biāo)線，以8 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

陰性空白溶液：按處方比例制備不含丹參及三七藥材的空白輔料，精密稱取1.0 g，置于具塞錐形瓶中，按供試品溶液制備方法制備陰性空白溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相pH 值選擇

選用同一份混合對(duì)照品溶液，考察流動(dòng)相A 的pH 值分別為8.6、8.4、8.2、8.0 時(shí)19 種氨基酸的分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同流動(dòng)相比例下，隨著流動(dòng)相A 的pH 值增大，谷氨酰胺、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸的分離效果越差，當(dāng)流動(dòng)相A 的pH 值為8.2 時(shí)，19 種氨基酸的分離效果最好，因此選擇流動(dòng)相A 的pH 值為8.2。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

19 種待測(cè)氨基酸中，有16 種為一級(jí)氨基酸，即前16 個(gè)色譜峰，可以與衍生劑OPA 反應(yīng)，在338 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰。羥脯氨酸、肌氨酸、脯氨酸（后3 個(gè)色譜峰）為二級(jí)氨基酸，可以與衍生劑FMOC 反應(yīng)，在262 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰。安捷倫1260 型液相色譜儀可以選擇多個(gè)通道同時(shí)測(cè)定待測(cè)物，也可選擇在某個(gè)時(shí)間段進(jìn)行波長(zhǎng)切換測(cè)定。OPA-賴氨酸衍生物和FMOC-羥脯氨酸衍生物兩個(gè)色譜峰間隔為0.6 min，因此可以選擇在這一時(shí)間段進(jìn)行波長(zhǎng)切換，從而能夠在同一色譜圖中同時(shí)檢測(cè)OPA 衍生化氨基酸和FMOC 衍生化氨基酸。

2.3 衍生劑用量選擇

OPA 衍生劑主要與一級(jí)氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，F(xiàn)MOC 衍生劑主要與二級(jí)氨基酸進(jìn)行反應(yīng)。如果在線衍生過(guò)程加入衍生劑OPA 與FMOC 的量過(guò)少，會(huì)導(dǎo)致19 種氨基酸不能得到充分衍生，影響定量結(jié)果。如果加入量過(guò)多，則進(jìn)樣口有多余的衍生劑，導(dǎo)致儀器堵塞甚至被損壞，因此需要對(duì)衍生劑OPA 與FMOC 的體積進(jìn)行考察。

以16 種一級(jí)氨基酸作為測(cè)定對(duì)象，考察衍生劑OPA 的用量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL 時(shí)16 種氨基酸的衍生效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)OPA 的用量為0.1～0.4 μL 時(shí)，16 種氨基酸的色譜峰面積隨著OPA 用量的增加而增大；當(dāng)OPA 的用量為0.4～0.6 μL 時(shí)，16 種氨基酸的色譜峰面積變化不明顯，說(shuō)明OPA 的用量為0.4 μL 時(shí)16 種一級(jí)氨基酸已得到充分衍生，因此選擇OPA 的用量為0.4 μL。

以3 種二級(jí)氨基酸作為測(cè)定對(duì)象，分別考察衍生劑FMOC 的用量為0.1～0.4 μL 時(shí)3 種氨基酸的衍生效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FMOC 用量為0.1～0.2 μL 時(shí)，3 種氨基酸的色譜峰面積隨著FMOC 用量的增加而增大；當(dāng)FMOC 的用量為0.2～0.4 μL 時(shí)，3 種氨基酸的色譜峰面積變化不明顯，說(shuō)明FMOC的用量為0.2 μL 時(shí)3 種二級(jí)氨基酸已得到充分衍生，因此選擇FMOC 的用量為0.2 μL。

2.4 專屬性考察

分別取適量1.4 中的陰性空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，陰性空白溶液不干擾測(cè)定結(jié)果，混合對(duì)照品溶液中19 種氨基酸的分離度均大于2.0，供試品溶液中各色譜峰的分離度均大于1.5，說(shuō)明該方法專屬性良好。

圖1 陰性空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液色譜圖

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1.4 中的混合對(duì)照品溶液，室溫放置，分別于配制后第0、1、2、4、8、16、24 h 時(shí)進(jìn)行在線衍生，在1.2 色譜條件下測(cè)定19 種氨基酸的色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，19 種氨基酸色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～1.5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 線性方程與檢出限

取1.4 中的19 種氨基酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)氨基酸的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。在1.2 色譜條件下對(duì)1＃溶液進(jìn)樣測(cè)定，以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的氨基酸質(zhì)量濃度為方法檢出限。

19 種氨基酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見(jiàn)表4。

表4 19 種氨基酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取復(fù)方丹參膠囊20 粒，將內(nèi)容物傾出，混勻，研磨成細(xì)粉，按1.4 方法平行制備6 份供試品溶液，在1.2 色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算樣品中各氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取0.5 g 已知氨基酸含量的復(fù)方丹參膠囊細(xì)粉，置于25 mL 容量瓶中，平行制備6 份，分別加入1.4 中的混合對(duì)照品溶液1.0 mL，按1.4方法制備加標(biāo)供試品溶液，在1.2 色譜條件下測(cè)定各氨基酸的色譜峰面積，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6 可知，19 種氨基酸的加標(biāo)平均回收率為91.4%～106.5%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表6 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品測(cè)定

取10 批復(fù)方丹參膠囊樣品，按1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下進(jìn)行在線衍生測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算樣品中各氨基酸的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），結(jié)果見(jiàn)表7。由表7 可知，不同生產(chǎn)廠家的復(fù)方丹參膠囊中氨基酸含量豐富，共檢測(cè)出異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸6 種人體必需的氨基酸。樣品中含量較高的氨基酸為門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、脯氨酸。不同廠家的樣品中氨基酸總量差異較大，因?yàn)槊總€(gè)廠家所用的丹參及三七的藥材來(lái)源各不同。

表7 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

樣品用0.1 mol／L 鹽酸溶液溶解，經(jīng)超聲提取后以O(shè)PA-FMOC 作為衍生試劑進(jìn)行在線衍生，建立了柱前在線衍生-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方丹參膠囊中19 種氨基酸含量的方法。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性良好，避免了傳統(tǒng)的人工衍生化過(guò)程帶來(lái)的操作誤差，并首次從氨基酸的角度評(píng)價(jià)復(fù)方丹參膠囊的質(zhì)量，為復(fù)方丹參膠囊質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。