李君李見王世信

在發(fā)達國家，糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）已成為慢性腎臟?。–hronic kidney disease，CKD）和腎功能衰竭（Renal failure，RF）的主要原因。在過去的二十年中，DN 的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)迅速上升[1，2]。除健康問題，DN 還增加了患者和社會的經(jīng)濟負擔。DN 進展迅速，患者能較快地發(fā)展為終末期腎病[3，4]。已有報道表明，DN的發(fā)病機制涉及代謝和血流動力學多因素的相互作用，如高血糖、腎素-血管緊張素系統(tǒng)和晚期糖基化終末產(chǎn)物[5]。但DN 的發(fā)病機制尚未完全明確，其潛在的干預靶點和途徑亟待挖掘。本研究利用生物信息學方法挖掘DN 發(fā)生和發(fā)展的潛在機制，為DN 的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 DN 差異表達基因篩選在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中檢索獲取芯片數(shù)據(jù)。下載GSE14 2153 數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含23 例DN 患者（DN 組）和10 例健康對照者（對照組）的外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的基因表達數(shù)據(jù)，實驗平臺為Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray4x44K G4112F（美國安捷倫）。利用R 語言軟件中的“l(fā)imma”和“pheatmap”對GSE 142153 數(shù)據(jù)集進行標準化處理，以P<0.05、|fold change|≥2 為條件進行差異表達基因篩選和聚類分析。

1.2 DN 差異表達基因富集分析以P<0.05 為條件，利用R 語言“ClusterProfiler”數(shù)據(jù)包對篩選得到的DN 差異表達基因進行信號通路和基因本體（Gene oncology，GO）富集分析，并將富集結(jié)果可視化。

1.3 DN 差異表達基因的蛋白質(zhì)相互作用（Proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建使用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）“Multiple Proteins”功能，設(shè)定物種為“智人”（Homo sapiens），將DN 差異表達基因?qū)胂到y(tǒng)檢索，設(shè)定評分分值>0.4，隱藏獨立的靶點，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值為參考，利用Cytoscape3.7.2 軟件（http://www.cytoscape.org）中的cytoHubba 插件篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點[6]。

1.4 DN 差異表達基因功能聚類利用基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）方法，借助GSEA v4.1.0 軟件分析DN 差異表達基因數(shù)據(jù)，以歸一化富集得分（Normalized enrichment score，NES）絕對值>1、P<0.05、錯誤發(fā)現(xiàn)率（False discovery rate，F(xiàn)DR）<0.25 為條件篩選DN 差異表達基因富集的生物學功能[7]，了解它們在特定功能基因集中的表達狀況。

2 結(jié)果

2.1 DN 差異表達基因篩選經(jīng)篩選，與正常對照組相比，DN 組樣本存在160 個差異基因，其中上調(diào)基因100 個，下調(diào)基因60 個，見表1。

表1 DN 差異表達基因

2.2 DN 差異表達基因富集分析上調(diào)的差異表達基因顯著富集于腫瘤壞死因子（TNF）、NOD 樣受體（NLR）、核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B（NF-κB）、白細胞介素17（IL17）等信號通路上，涉及平滑肌細胞增殖等生物學功能；下調(diào)差異表達基因顯著富集在趨化因子信號通路上，涉及巨噬細胞遷移調(diào)節(jié)等生物學功能，見圖1。

圖1 DN 差異表達基因富集分析

2.3 DN 差異表達基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和信號通路富集分析白細胞介素6（IL6）、CXC 趨化因子配體8（CXCL8）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、白細胞介素1B（IL1B）是DN 上調(diào)差異表達基因PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點；細胞表面趨化因子受體2（CCR2）、趨化因子（C-X3-C-基元）受體1（CX3CR1）是DN下調(diào)差異表達基因PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點，見圖2。

圖2 DN 差異表達基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 DN 差異表達基因功能聚類DN 差異表達基因富集于血管新生、細胞凋亡、缺氧、凝血等生物學過程，見圖3。

圖3 DN 差異表達基因生物學功能富集

3 討論

DN 是最常見的慢性腎臟疾病，也是終末期腎功能衰竭的主要原因。DN 被認為是血流動力學和代謝因素相互作用的結(jié)果，其發(fā)病機制涉及多因素、多途徑，其中免疫反應和炎癥起主要作用[8]。慢性腎功能不全與腎臟炎癥有關(guān)，巨噬細胞及NF-κB 信號通路參與其中[9]。高血糖狀態(tài)可激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，導致腎臟組織的巨噬細胞浸潤，誘導細胞因子釋放和單核巨噬細胞募集，最終導致炎癥反應，同時，肥大細胞等炎性相關(guān)細胞也滲入腎小管間質(zhì)，釋放炎癥介質(zhì)和蛋白水解酶，參與這一病理過程[10]。

NF-κB 信號通路是經(jīng)典的炎性反應通路，控制著參與免疫反應和炎癥等不同過程的基因的表達。在DN 發(fā)病過程中，NF-κB 信號通路會調(diào)控腎臟結(jié)構(gòu)改變和功能異常等分子和生物學途徑，如腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活、晚期糖基化終末產(chǎn)物的積累和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸主導的氧化應激等，處于DN 相關(guān)炎性反應的核心地位[11]。

TNF-α 在DN 發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，可通過影響白細胞的募集和激活，加劇DN 相關(guān)的炎癥反應。TNF-α 與兩種細胞表面受體——TNFα 受體1 和2 相互作用發(fā)揮其生物學作用，這兩種受體已被認為是一種新的預測DN 預后的生物標志物[12]。在DN 中，TNF-α 及其受體參與細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞外基質(zhì)蛋白的合成，并介導對足細胞、系膜細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞的多種細胞毒作用[13]。一項薈萃分析表明，2 型糖尿病患者和DN 患者血清TNF-α 濃度均增加，且DN 患者血清TNF-α 濃度高于2 型糖尿病患者[14]。

NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3)是經(jīng)典的炎癥因子，活性氧誘導激活的NLRP3 參與腎損傷的發(fā)生發(fā)展。糖尿病患者體內(nèi)活性氧水平升高，當NLRP3 激活時，NLRP3 可同時激活半胱氨酸蛋白酶-1（CP-1），誘導炎反應[15]。研究證實，NLRP3 在DN 大鼠腎臟中高表達，而NLRP3 炎性小體下游的IL-1 和IL-18 水平也明顯升高，提示DN 的發(fā)生和發(fā)展與NLRP3 的激活有關(guān)[16]。

IL-17A 是先天免疫的重要調(diào)節(jié)因子，主要由Th17 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞和肥大細胞產(chǎn)生，與多種炎癥性疾病的發(fā)病機制有關(guān)。有研究表明，IL-17A 缺乏可減輕移植腎的急慢性損傷，改善腎功能，延長移植腎存活時間[17]。但目前IL-17 在DN 中的具體作用尚未完全明確。Kim等[18]報道，通過霉酚酸酯靶向Th17 細胞減輕DN模型小鼠腎損傷，表明調(diào)節(jié)IL-17 可能是治療DN的可行方法。另有研究證實，在糖尿病大鼠模型中，用雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制劑治療可以減弱Th17 活性和腎臟損傷[19]。與上述研究結(jié)果不同，Mohamed 等[20]研究證實，IL-17A 和IL-17F 對DN有保護作用。Ma 等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，IL-17 缺乏癥減弱了DN 模型小鼠促炎基因的表達，表明IL-17對鏈脲佐菌素誘導的DN 具有保護作用。

趨化因子在細胞募集和遷移中起關(guān)鍵作用，根據(jù)功能不同，趨化因子又被定義為穩(wěn)態(tài)趨化因子和炎性趨化因子，其中炎性趨化因子與促炎機制有關(guān)，并誘導白細胞向受損組織募集[22]。趨化因子與DN 的發(fā)生密切相關(guān)。當間充質(zhì)干細胞暴露在DN 的炎癥環(huán)境中時，可以通過釋放趨化因子來協(xié)調(diào)局部和全身的先天和適應性免疫反應[23]。在DN動物模型中，不同家族的眾多趨化因子，如CCL2、CCL20、CXCL5、CXCL7 和CXCL12，在腎小球和近端小管中增加[24，25]。

經(jīng)拓撲分析，IL6、CXCL8、MMP9、IL1B 是DN上調(diào)差異表達基因PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點，CCR2、CX3CR1 是DN 下調(diào)差異表達基因PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點。IL-6 是一種在炎癥病理中起關(guān)鍵作用的細胞因子。一項評估IL-6 與DN 發(fā)病相關(guān)性的薈萃分析研究表明，IL-6 的等位基因，如rs1800795、rs1800796 和rs1800797 在DN 的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用[26]。另有研究證實，DN 患者尿液中IL-6 水平升高，這一現(xiàn)象在腎臟預后較差的患者中尤為明顯[27]。重組人趨化因子CXCL8（IL-8）及其受體是DN 進展的主要參與者。IL-8 主要激活中性粒細胞募集并誘導氧化應激，增加DN 的血管通透性和內(nèi)皮損傷[28]。在亞洲人群中，IL-8 的等位基因IL8-rs4073 與DN 的發(fā)生有很強的相關(guān)性[29]。研究表明，CXCL8 升高是導致糖尿病小鼠腎臟損傷和中性粒細胞積聚的關(guān)鍵因素，在糖尿病小鼠模型中應用CXCL8 拮抗劑（G31P），G31P 治療組腎功能障礙明顯減輕[30]。IL-1β 由巨噬細胞產(chǎn)生，是免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子，可觸發(fā)腎細胞產(chǎn)生其他次級促炎介質(zhì)[31]。臨床研究表明，IL-1β 受體拮抗劑-阿那白滯素（Anakinra）可改善血糖和β 細胞功能，降低全身炎癥標志物[32]。另有研究表明，新的IL-1β抑制劑——利納西普（Rilonacept）降低了慢性腎臟病患者的全身炎癥反應[33]。CC 族趨化因子受體2（CCR2）參與免疫炎性反應，CC 族趨化因子配體2（CCL2）水平升高與腎小球損傷、腎臟炎癥和腎功能下降密切相關(guān)。研究表明，CCR2 拮抗劑可以降低DN 腎臟巨噬細胞的聚集和損傷[34]。實驗研究表明，阻斷CCR2 受體可以減少DN 模型小鼠蛋白尿和降低腎小球纖維化水平，恢復腎功能[35]。趨化因子受體CX3CR1 在單核細胞和循環(huán)淋巴細胞中高表達，與腎臟疾病密切相關(guān)。研究表明，CX3CR1 的配體CX3CL1 可通過特異性阻斷巨噬細胞上的CX3CR1表達，發(fā)揮減少缺血腎臟巨噬細胞的浸潤作用，減輕缺血再灌注損傷后的腎纖維化改變[36]。

GSEA 富集分析表明，DN 發(fā)病涉及血管新生、細胞凋亡、缺氧、凝血等生物學過程。Wilson 等[37]對DN 腎臟標本進行單細胞測序發(fā)現(xiàn)，腎小球、近曲小管、遠曲小管的細胞呈現(xiàn)典型的血管新生表型。Jin 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞外泌體可以上調(diào)足細胞miR-486 的表達，抑制Smad1/mTOR 信號通路，減少細胞凋亡，改善DN 癥狀，表明DN 發(fā)病涉及細胞凋亡表型。腎小管缺氧是DN 早期和晚期的共同特征，DN 動物模型中，近端腎小管上皮細胞和DN 患者腎組織中缺氧誘導因子-1α 表達升高[39]。糖尿病患者的血液呈高凝狀態(tài)，可加重腎臟損傷，DN 患者活化部分凝血活酶時間縮短，提示DN 患者內(nèi)源性凝血功能增強[40]。

綜上所述，與健康人群相比，DN 患者PBMCs基因表達存在顯著差異，其病理過程與TNF、NLR、NF-κB、IL-17、趨化因子等信號通路有關(guān)。IL6、CXCL8、MMP9、IL1B、CCR2、CX3CR1 是DN 發(fā) 病過程中的核心靶點。DN 病理過程涉及血管新生、細胞凋亡、缺氧、凝血等生物學過程。