鄧湘 賀兼斌 劉理靜 龍興云

近5年的流行病學(xué)調(diào)查顯示肺部惡性腫瘤是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺部惡性腫瘤最常見(jiàn)的類型，占比超過(guò)85%[1～3]。近年NSCLC 的診斷率明顯提高，但患者5年生存率僅為15.6%[4]。目前NSCLC 治療的首選仍是化療，但化療藥物副作用大、治療費(fèi)用高等問(wèn)題導(dǎo)致患者難以完成全部周期化療，使得化療的治療有效率低于15%[5]。因此，從天然植物中提取并開發(fā)安全性高、價(jià)格低廉且對(duì)腫瘤治療有效的藥物十分迫切。

瞬時(shí)受體電位M（Transient receptor potential melastatin，TRPM）成員在各種癌癥中的作用已經(jīng)被證實(shí)，其中一個(gè)通道TRPM8 是鈣離子（Ca2+）滲透性通道，TRPM8 的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致乳腺、肺部、胰腺和前列腺惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6～9]。因此，TRPM 蛋白可能是影響腫瘤治療效果的重要靶點(diǎn)。

果王素是通過(guò)臨界CO2萃取法從獼猴桃果仁中萃取而成的果仁油，主要有效成分為非飽和脂肪酸（α-亞麻酸），萃取的果仁油具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[10～12]。課題前期研究發(fā)現(xiàn)，果王素可抑制小鼠肺腺癌的生長(zhǎng)[12～14]。然而，果王素能否通過(guò)調(diào)控TRPM8 的表達(dá)對(duì)肺腺癌產(chǎn)生抑制作用尚不清楚。本研究觀察不同劑量果王素對(duì)肺腺癌小鼠移植瘤生長(zhǎng)及腫瘤組織中TRPM8 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心購(gòu)買Lewis 肺腺癌荷瘤種鼠2 只和C57BL/6J小鼠32 只。C57BL/6J 小鼠均為雄性，4～5 周齡，無(wú)特定病原體（Specefic pathogen free，SPF）級(jí)，體質(zhì)量（20±2）g，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK[京] 2019-0019。果王素由湘西老爹生物有限公司提供，為黃色油性液體，每升液體含果王素600g。兔抗鼠TRPM8 抗體和兔抗β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司；Trizol 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物公司；PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于加拿大Fermentas 公司；TRPM8、β-actin 引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 建立動(dòng)物模型 按照本課題組前期報(bào)道的方法建模[14]。無(wú)菌環(huán)境下，將處死的Lewis 肺腺癌荷瘤種鼠剝離腫瘤，留取腫瘤組織。按1g 組織∶4ml NaCl 的比例在表面皿中剪碎腫瘤組織，剪碎后的組織進(jìn)行研磨；研磨后經(jīng)0.042mm 孔徑360 目鋼網(wǎng)濾過(guò)，使用生理鹽水將組織過(guò)濾液調(diào)節(jié)成細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)/ml 的瘤細(xì)胞懸液。在C57BL/6J 小鼠右后腿根部外側(cè)，皮下注射0.2ml 腫瘤細(xì)胞懸液，建立肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型。

1.2.2 分組及處理 按隨機(jī)數(shù)字表法將32 只小鼠分為對(duì)照組、低劑量果王素組（60mg/kg）、中劑量果王素組（120mg/kg）、高劑量果王素組（240mg/kg）。接種腫瘤細(xì)胞后第4 天對(duì)照組予以生理鹽水0.3ml 灌胃，每日1 次；低劑量果王素組予以60mg/kg 果王素0.3ml 灌胃，每日1 次；中劑量果王素組予以120mg/kg果王素0.3ml 灌胃，每日1 次；高劑量果王素組予以240mg/kg 果王素0.3ml 灌胃，每日1 次。接種后第24天處死全部小鼠并剝離皮下移植瘤。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)小鼠移植瘤組織TRPM8 mRNA表達(dá) 取部分腫瘤組織加入液氮研磨，以Trizol試劑提取各組腫瘤組織樣本中的總RNA，按照Fermentas 公司RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。目的基因TRPM8 的參數(shù)：95℃預(yù)變性30s，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35 個(gè)循環(huán)。TRPM8 上游引物序列為5'-TGCCATCTCCTA CGCTCTA-3'，下游引物序列為5'-TTCGCAACCAGT TTCCAG-3'。內(nèi)參β-actin 的上游引物序列為5'-CA CGGCATTGTAACCAACTG-3'，下游引物序列為5'-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3'。產(chǎn) 物長(zhǎng)度400bp。內(nèi)參β-actin 的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1min，95℃變性5s，60℃退火20s，72℃延伸15s，共40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參定量TRPM8 mRNA 的表達(dá)水平。

1.2.4 Western blot 法檢測(cè)小鼠移植瘤組織TRPM8蛋白水平 加入液氮研磨部分腫瘤組織，使用RIPA 蛋白裂解液從腫瘤組織中提取細(xì)胞蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉蛋白膜、一抗和二抗孵育、ECL 法顯影，使用Image J 軟件分析顯影條帶，以β-actin（43kDa）為內(nèi)參，測(cè)定TRPM8（38kDa）蛋白的表達(dá)，經(jīng)Labwork 凝膠圖像分析系統(tǒng)計(jì)算TRPM8 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況小鼠于接種腫瘤細(xì)胞后第24 天均存活。接種后第4 天，小鼠右側(cè)后腿根部外側(cè)處均見(jiàn)小結(jié)節(jié)樣腫瘤生長(zhǎng)。各組小鼠皮下移植瘤在第4～10 天大致相同，第16～24 天果王素組小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，果王素組皮下移植瘤的體積、質(zhì)量均減?。≒<0.05）；與低劑量果王素組相比，中劑量、高劑量果王素組皮下移植瘤的體積、質(zhì)量均減小，且高劑量果王素組減小更明顯（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠移植瘤生長(zhǎng)情況比較（±s）

表1 各組小鼠移植瘤生長(zhǎng)情況比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與低劑量果王素組相比，bP<0.05；與中劑量果王素組相比，cP<0.05

分組 n 腫瘤體積（cm3） 腫瘤質(zhì)量（g）對(duì)照組 8 6.79±0.23 6.10±.0.19低劑量果王素組 8 6.15±0.26a 5.49±0.29a中劑量果王素組 8 5.67±0.14ab 4.97±0.19ab高劑量果王素組 8 4.98±0.29abc 3.82±0.21abc

2.2 各組小鼠皮下移植瘤組織TRPM8 的mRNA表達(dá)水平RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，果王素組皮下移植瘤組織TRPM8 mRNA 表達(dá)均不同程度降低（P<0.05）；與低劑量果王素組相比，中劑量、高劑量果王素組皮下移植瘤組織TRPM8 mRNA 表達(dá)均降低，且高劑量果王素組降低更明顯（P<0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組移植瘤組織TRPM8 mRNA 表達(dá)

2.3 各組小鼠皮下移植瘤組織TRPM8 的蛋白表達(dá)水平Western blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，果王素組皮下移植瘤組織TRPM8 蛋白表達(dá)均不同程度降低（P<0.05）；與低劑量果王素組相比，中劑量、高劑量果王素組皮下移植瘤組織TRPM8蛋白表達(dá)均降低，且高劑量果王素組降低更明顯（P<0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 TRPM8 蛋白在各組中的表達(dá)

表2 各組移植瘤組織中TRPM8 mRNA 及蛋白表達(dá)（±s）

表2 各組移植瘤組織中TRPM8 mRNA 及蛋白表達(dá)（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與低劑量果王素組相比，bP<0.05；與中劑量果王素組相比，cP<0.05

分組 n TRPM8 mRNA TRPM8 蛋白對(duì)照組 8 85.54±1.53 100.34±3.22低劑量果王素組 8 68.21±2.11a 83.10±2.65a中劑量果王素組 8 59.41±1.43ab 75.66±3.48ab高劑量果王素組 8 43.97±2.66abc 60.55±3.51abc

3 討論

NSCLC 是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌[15]。隨著生活水平提高，人們對(duì)健康的要求也不斷提升，從天然植物中提取和開發(fā)安全有效的抗癌藥物已成為防治肺癌的新手段。研究顯示，許多天然植物的化合物如黃芪多糖、參麥、姜黃素等具有抑制肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[16～18]。非飽和脂肪酸（α-亞麻酸）為果王素主要藥理成分。本研究復(fù)制高轉(zhuǎn)移肺腺癌皮下移植瘤動(dòng)物模型，使用不同劑量的果王素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示：對(duì)照組皮下移植瘤的體積、質(zhì)量明顯大于各劑量果王素組，并且隨著果王素處理劑量的增大抑制腫瘤生長(zhǎng)效果越明顯，尤其以240mg/kg果王素效果最強(qiáng)，各組間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

腫瘤的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)是離子通道，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度超標(biāo)將降低細(xì)胞存活率，TRPM8 是一個(gè)非選擇性陽(yáng)離子通道，通過(guò)控制Ca2+流動(dòng)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外的平衡。TRPM8 通道激活后允許Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)，Ca2+又作為第二信使調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為[19]。TRPM8 被認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮作用且與患者的不良預(yù)后有關(guān)[20，21]。為探討果王素能否通過(guò)影響TRPM8 的表達(dá)起到抑制肺腺癌生長(zhǎng)的作用，本研究采用RT-PCR 檢測(cè)小鼠皮下移植瘤中TRPM8 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果表明果王素干預(yù)可降低腫瘤組織中TRPM8 mRNA 的表達(dá)，果王素的劑量越大，則TRPM8 mRNA 的表達(dá)越低。Western blot 法檢測(cè)TRPM8 蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明對(duì)照組TRPM8 蛋白表達(dá)較高，而60mg/kg、120mg/kg、240mg/kg 果王素干預(yù)后TRPM8蛋白的表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)，其中240mg/kg 果王素干預(yù)降低最明顯。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示果王素對(duì)肺腺癌移植瘤的生長(zhǎng)有良好的抑制效果，并與劑量相關(guān)。

綜上所述，果王素能抑制肺腺癌小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與降低TRPM8 基因表達(dá)及減少TRPM8 蛋白產(chǎn)物有關(guān)，本研究為果王素應(yīng)用于治療肺癌提供了理論與藥理學(xué)依據(jù)。果王素作為一種容易獲取的生物提取物，具有潛在的應(yīng)用前景。