夏 奎，王 安，鐘昌秀

（1.博鰲超級醫(yī)院胸心外科，瓊海 571400；2.瓊海市人民醫(yī)院胸心外科，瓊海 571400）

肺癌是世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)死亡的主要原因，非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌患者的85%。目前，盡管診斷技術(shù)和治療策略取得了巨大進步，但NSCLC 患者的預(yù)后仍然較差，且患者的總體5 年生存率僅為10%[1]。早期發(fā)現(xiàn)率低是導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率的主要原因之一[2]。因此，探索NSCLC的新型治療靶點對改善患者預(yù)后，提高患者生存率至關(guān)重要。環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNA）是由外顯子反向剪接形成的非編碼RNA分子，circRNA與人類癌癥的發(fā)展密切相關(guān)，包括NSCLC[3-4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，circ-EIF4G3在NSCLC中表達上調(diào)，并可能參與NSCLC 發(fā)生過程[5]。但是，circ-EIF4G3 在NSCLC中的作用機制仍不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是另一組內(nèi)源性非編碼RNA，先前研究表明，circRNA 可通過充當(dāng)miRNA 海綿發(fā)揮作用[6]。Wang等[7]研究顯示，circ-EIF4G3通過海綿吸附miR-335 促進胃癌的增殖、侵襲和遷移。但是，circ-EIF4G3 及其靶miRNA 在NSCLC 進展中的作用仍不清楚。本研究旨在探討circ-EIF4G3在NSCLC腫瘤發(fā)生中的功能及分子機制，以期為NSCLC 的診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人非小細胞肺癌細胞系（NCI-H1299、NCIH520和NCI-H460）和人正常肺上皮細胞系（BEAS-2B）由中國科學(xué)院上海細胞庫提供；DMEM 高糖培養(yǎng)基由美國Gibco 公司提供；胎牛血清由南京凱基生物科技有限公司提供；Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑由美國Invitrogen 公司提供；circ-EIF4G3 siRNA 和siRNA 對照、miR-17-5p mimics 和mimics對照由廣州銳博生物科技有限公司提供；CCK-8試劑由日本同仁化學(xué)研究所提供；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR 檢測試劑盒由賽默飛世爾科技有限公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司提供；Annexin V-FITC/PI雙染色細胞凋亡檢測試劑盒由大連寶生物工程有限公司提供；雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒由上海翊圣生物科技有限公司提供；circ-EIF4G3-Wt 和circ-EIF4G3-Mut重組載體質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；Cleaved Caspase-3單克隆抗體和二抗由美國CST公司提供；Western blotting 檢測所需試劑由碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

BEAS-2B、NCI-H1299、NCI-H520 和NCI-H460細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，放置在常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件：5%CO2，37 ℃，飽和濕度。當(dāng)細胞融合至90%左右時，使用0.25%的胰蛋白酶消化細胞并傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期的細胞進行實驗。取對數(shù)生長期的NCI-H1299細胞接種到6孔板中，過夜培養(yǎng)，待細胞生長匯合度在50%左右時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染circ-EIF4G3 siRNA的NCI-H1299細胞記為轉(zhuǎn)染（si-circ-EIF4G3）組，轉(zhuǎn)染siRNA 對照的NCI-H1299 細胞記為轉(zhuǎn)染對照（si-NC）組，其中未行轉(zhuǎn)染的NCI-H1299細胞記為空白對照（Mock）組。具體轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑使用說明進行，轉(zhuǎn)染6 h 時更換成正常培養(yǎng)液，48 h 后收集各組NCIH1299細胞，進行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.3 qPCR檢測

BEAS-2B、NCI-H1299、NCI-H520 和NCI-H460細胞以及轉(zhuǎn)染48 h 后的各組NCI-H1299 細胞分別采用Trizol試劑提取總RNA，分別測定RNA樣品的濃度和純度，取合格的RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，具體步驟參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行操作。以合成的cDNA為模板，使用SYBR Green qPCR 檢測試劑盒行qPCR 檢測，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，隨后設(shè)40個循環(huán)：95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s。以GAPDH 為內(nèi)參，分析circ-EIF4G3 的相對表達量，以U6 為內(nèi)參，分析miR-17-5p 的相對表達量。每組實驗重復(fù)3 次。采用相對定量2-ΔΔCt法進行定量。qPCR 所用引物序列為，GAPDH，F(xiàn)：5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’；R 5’-ATGGCATGG ACTGTGGTCAT-3’。circ-EIF4G3，F(xiàn)：5’-CCTACCCCATCCCCTTATTC-3’；R：5’-ACCGTGCTGTAGACTGCTGAG-3’。U6，F(xiàn)：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。miR-17-5p，F(xiàn)：5’-CCAGGATCCTTTATAGTTGTTAGAGTTT-3’；R：5’-CGGAATTCTAATCTACTTCACTATCTGCAC-3’。

1.4 CCK-8實驗

將對數(shù)期NCI-H1299細胞鋪板96孔板，分組轉(zhuǎn)染48 h時檢測細胞增殖活力，即向每孔細胞中加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，棄上清，使用全自動酶標(biāo)儀測定490 nm 處各孔細胞吸光度（A）值。每組實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h 后的NCI-H1299 細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL，向細胞中加入預(yù)冷的75%的乙醇，于4 ℃冰箱固定12 h，使用PBS 洗滌細胞，加入適量核糖核酸酶，37 ℃避光水浴30 min，隨后加入PI 染液，避光孵育5 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。每組實驗重復(fù)3次。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測

NCI-H1299 細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，加入胰蛋白酶消化并收集細胞，向細胞中加入400 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，再向細胞懸液中依次添加Annexin V-FITC和PI各5 μL，輕輕分混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，立即上流式細胞儀，檢測細胞凋亡情況，檢測結(jié)果以Cell Quest軟件分析細胞凋亡率。每組實驗重復(fù)3次。

1.7 Western blotting檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組NCI-H1299 細胞，加入細胞裂解液，放置在冰上裂解15 min，離心取上清即為總蛋白，采用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，取40 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，待蛋白分離后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，室溫封阻2 h。加入1∶1 000 稀釋的Cleaved Caspase-3 單克隆抗體，4 ℃過夜孵育，次日加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光液進行顯影，在暗室使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用Imag J 軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 進行標(biāo)定，計算Cleaved Caspase-3相對表達水平。每組實驗重復(fù)3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，擴增circ-EIF4G3和miR-17-5p 結(jié)合位點和突變位點序列，并插入熒光素酶報告載體上，分別構(gòu)建circ-EIF4G3-Wt 和circ-EIF4G3-Mut 重組載體質(zhì)粒。使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將circ-EIF4G3-Wt 和circ-EIF4G3-Mut重組載體質(zhì)粒分別和miR-17-5p mimics或mimics 對照共轉(zhuǎn)染NCI-H1299 細胞，48 h 后收集細胞，并使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒測定海腎和螢火蟲熒光素酶活性，分別計算細胞的相對熒光素酶活性。每組實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ-EIF4G3 和miR-17-5p 在NSCLC 細胞中的表達

與人正常肺上皮細胞系BEAS-2B 相比，人NSCLC 細胞系NCI-H1299、NCI-H520 和NCI-H460中circ-EIF4G3 的表達水平顯著升高（P＜0.05），而miR-17-5p 的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表1。circ-EIF4G3在NCI-H1299細胞中基礎(chǔ)表達量最高，因此，選擇NCI-H1299細胞用于后續(xù)實驗。

表1 circ-EIF4G3 和miR-17-5p 在NSCLC 各細胞系中的相對表達水平比較，n=3

表1 circ-EIF4G3 和miR-17-5p 在NSCLC 各細胞系中的相對表達水平比較，n=3

與BEAS-2B細胞系相比，*P＜0.05。

2.2 抑制circ-EIF4G3 對NCI-H1299 細胞增殖活力的影響

與Mock 組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3 組NCI-H1299 細胞中circ-EIF4G3 的表達水平顯著降低（P＜0.05）；Mock 組和si-NC 組相比，NCI-H1299細胞中circ-EIF4G3 的表達水平差異不明顯（P＞0.05）。與Mock 組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3組NCI-H1299 細胞增殖活力顯著降低（P＜0.05）；Mock 組和si-NC 組相比，NCI-H1299 細胞增殖活力差異不明顯（P＞0.05），見表2。

表2 各組NCI-H1299 細胞增殖活力和circ-EIF4G3 相對表達量比較，n=3

表2 各組NCI-H1299 細胞增殖活力和circ-EIF4G3 相對表達量比較，n=3

與Mock組相比，*P＜0.05；與si-NC組相比，&P＜0.05。

2.3 抑制circ-EIF4G3 對NCI-H1299 細胞周期的影響

與Mock 組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3 組G0/G1期細胞比例顯著增多（P＜0.05），而S 期和G2/M期細胞比例隨之減少（P＜0.05）；Mock組和si-NC組相比，G0/G1期、S 期和G2/M 期細胞比例差異不明顯（P＞0.05），見表3。

表3 各組G0/G1期、S期和G2/M期細胞比例比較，n=3

表3 各組G0/G1期、S期和G2/M期細胞比例比較，n=3

與Mock組相比，*P＜0.05；與si-NC組相比，&P＜0.05。

2.4 抑制circ-EIF4G3 對NCI-H1299 細胞凋亡的影響

與Mock 組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3 組NCI-H1299細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表達水平明顯升高（均P＜0.05）；Mock 組和si-NC 組相比，細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 的表達水平差異不明顯（P＞0.05），見圖1和表4。

表4 各組NCI-H1299細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表達水平比較，n=3

表4 各組NCI-H1299細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表達水平比較，n=3

與Mock組相比，*P＜0.05；與si-NC組相比，&P＜0.05。

圖1 抑制circ-EIF4G3對NCI-H1299細胞凋亡的影響

2.5 circ-EIF4G3靶向調(diào)控miR-17-5p關(guān)系驗證

生物信息學(xué)Starbase 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，circ-EIF4G3 和miR-17-5p 間存在靶向結(jié)合位點。與miR-NC 組相比，過表達miR-17-5p 的circ-EIF4G3-Wt 細胞相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而過表達miR-17-5p的circ-EIF4G3-Mut細胞相對熒光素酶活性差異不明顯（P＞0.05）。與Mock組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3 組NCI-H1299 細胞中的miR-17-5p表達水平明顯降低（均P＜0.05）；Mock 組和si-NC 組相比，miR-17-5p 的表達水平差異不明顯（P＞0.05），見圖2和表5。

表5 各組NCI-H1299細胞中miR-17-5p表達水平比較，n=3

表5 各組NCI-H1299細胞中miR-17-5p表達水平比較，n=3

與Mock組相比，*P＜0.05；與si-NC組相比，&P＜0.05。

圖2 circ-EIF4G3和miR-17-5p靶向關(guān)系驗證

3 討論

circRNA 是一類新的廣泛存在的內(nèi)源性RNA。circRNA具有兩個最重要的特性即它們高度保守且非常穩(wěn)定，這些優(yōu)點使circRNA 具有成為癌癥診斷的理想生物標(biāo)志物的潛力[8]。circRNA 報道最多的功能模式是充當(dāng)miRNA 海綿。這種“海綿狀”特征類似于長非編碼RNA（lncRNA），這表明circRNA是與miRNA結(jié)合作為miRNA的分子吸收劑發(fā)揮調(diào)控作用。例如，circ-MYBL2 作為miR-361-3p 的海綿，可促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲[9]。在前列腺癌中，circ-MTO1與患者良好的預(yù)后相關(guān)，并能夠通過靶向抑制miR-17-5p表達抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲[10]。在NSCLC 中，circ-CMPK1 通過海綿吸附miR-302e 來增加細胞周期蛋白D1 的表達，從而促進NSCLC細胞增殖[11]。NSCLC是最常見的肺部惡性腫瘤，其特征是肺組織中細胞的增殖不受控制[12]。近年來，基因芯片技術(shù)已公開了許多與NSCLC 相關(guān)的circRNA[13]。先前的研究表明，circRNA 參與了一系列涉及NSCLC 腫瘤發(fā)生和發(fā)展的生理過程[14-15]。在以往研究中，與匹配的非癌組織和正常肺16HBE細胞相比，在肺癌患者標(biāo)本組織和肺癌細胞中circ-EIF4G3表達被證實過表達[5]。本實驗的數(shù)據(jù)同樣證實了circ-EIF4G3在NSCLC細胞系中的表達上調(diào)，這意味著circ-EIF4G3可能是肺癌中的一種癌基因。

既然已驗證circ-EIF4G3 在肺癌組織和肺癌細胞中上調(diào)表達，則進一步的功能實驗對于驗證其他生物學(xué)效應(yīng)是必要的。體外試驗揭示了抑制circ-EIF4G3 能夠阻礙NSCLC 細胞增殖和細胞周期進程，并促進細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡過程中終末剪切酶，在細胞凋亡中扮演重要角色[16]。Caspase-3 激活水平在一定程度上反映細胞凋亡程度。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制circ-EIF4G3后NCI-H1299細胞中Cleaved Caspase-3 的表達水平顯著升高，表明抑制circ-EIF4G3 可通過上調(diào)Cleaved Caspase-3 的表達促進NCI-H1299 細胞凋亡。因此，發(fā)現(xiàn)circ-EIF4G3具有NSCLC致癌作用，為NSCLC的治療提供了有價值的標(biāo)志物。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，與circ-EIF4G3 的表達水平相反，miR-17-5p 在NSCLC細胞系中的表達顯著降低，且抑制circ-EIF4G3能夠促進miR-17-5p的表達。筆者推測circ-EIF4G3可能通過調(diào)控miR-17-5p 的表達參與NSCLC 的發(fā)展。在各種類型的癌癥（包括甲狀腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌）中，miR-17-5p 的表達均下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用[17-19]。多項研究已證實，miR-17-5p 在NSCLC 組織和細胞系中顯著降低，且miR-17-5p 過表達明顯抑制細胞增殖，同時誘導(dǎo)細胞凋亡[20-22]。本實驗生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，circ-EIF4G3和miR-17-5p 存在靶向結(jié)合位點，表明circ-EIF4G3和miR-17-5p之間可能存在靶向關(guān)系。后續(xù)通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蛁PCR 技術(shù)證實，circ-EIF4G3 能夠負向調(diào)控miR-17-5p 的表達。以上的實驗結(jié)果，證明了circ-EIF4G3 通過海綿miR-17-5p在NSCLC中起致癌作用。

綜上，circ-EIF4G3在NSCLC中表達上調(diào)，抑制circ-EIF4G3通過調(diào)節(jié)miR-17-5p抑制NCI-H1299細胞增殖和細胞周期進程，并誘導(dǎo)細胞凋亡，在NSCLC中起癌基因的作用。本研究結(jié)果表明，miR-17-5p作為NSCLC的預(yù)后預(yù)測因子和治療靶標(biāo)可能具有較大的潛力。