李海玲，董陸玲，楊亞萍，楊秀紅，張貴山

（張家口市第一醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科，2.呼吸科，張家口 075000）

糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎病的主要原因。目前，糖尿病腎病患者數(shù)約占終末期腎病患者的50%[1]。在糖尿病腎病的發(fā)展過程中，腎功能的下降與腎纖維化的程度密切相關(guān)，尤其是腎小管間質(zhì)纖維化[2]。腎小管上皮細胞損傷誘導的細胞上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認為是導致腎纖維化的關(guān)鍵因素[3]。但糖尿病中腎小管上皮細胞EMT 的詳細分子機制尚不明確。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶-1(protein arginine methyltranferase-1，PRMT1)可控制多種底物基因的表達，并調(diào)節(jié)正常生理和病理發(fā)育過程中的一系列生物學進程[4]。已有研究表明，高糖可誘導糖尿病腎病小鼠足細胞中PRMT1表達上調(diào)。抑制PRMT1表達可減輕足細胞凋亡和EMT，從而改善糖尿病腎病小鼠足細胞損傷[5]。PRMT1 的主要下游底物可能涉及EMT 信號通路的幾個關(guān)鍵成分，如鋅指蛋白SNAⅠ1(zinc finger protein SNAⅠ1，Snail)、鋅指蛋白SNAⅡ(zinc finger protein SNAⅡSLUG)、扭曲相關(guān)蛋白1(twistrelated protein 1，Twist1)和鋅指E 盒結(jié)合同源框1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)[6]。目前，已有證據(jù)顯示，PRMT1 可通過上調(diào)ZEB1 表達調(diào)節(jié)人類乳腺癌細胞EMT 和衰老[7]。然而，目前還不清楚PRMT1 是否通過調(diào)控ZEB1 表達在糖尿病腎病EMT 中發(fā)揮作用。因此，本研究旨在探究PRMT1 是否通過調(diào)控ZEB1 表達在高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和EMT中發(fā)揮作用，以期為明確糖尿病中腎小管上皮細胞EMT 的詳細分子機制及開發(fā)新的糖尿病腎病治療靶點提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人腎小管上皮細胞系HK-2購自中國科學院細胞庫；siRNA 陰性對照（si-NC）、過表達載體陰性對照（oe-NC）、PRMT1 特異性siRNA（si-PRMT1）、ZEB1 過表達載體（oe-ZEB1）購自蘇州泓迅生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CCK-8 檢測試劑盒購自吉滿生物科技(上海)有限公司；Annexin V FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix購自美國Bimake；PRMT1、ZEB1 和GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司；E-cadherin、Fibronectin 和α-SMA 抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；SimpleChIP? Plus Sonication Chromatin IP 試劑盒購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 細胞培養(yǎng)及高糖處理

取出凍存的HK-2細胞，37 ℃水浴快速解凍，離心收集細胞。用含10%FBS、100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，并將凍存管內(nèi)的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)。將盛有細胞的培養(yǎng)皿放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞密度達到80%～90%時，用0.25%胰酶液消化細胞。將細胞接種于6 孔板內(nèi)，1×105個/孔，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，將細胞隨機分為空白對照組和高糖組，對照組細胞用含2%FBS、葡萄糖5.5 mmol/L 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖組細胞用含2%FBS、葡萄糖30 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細胞分組及轉(zhuǎn)染

將對數(shù)期生長的HK-2細胞接種于6孔板中，2×105個/孔，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為空白對照組（正常培養(yǎng)且無轉(zhuǎn)染處理）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）和si-PRMT1組（轉(zhuǎn)染si-PRMT1）或者是空白對照組（正常培養(yǎng)且無轉(zhuǎn)染處理）、si-NC+oe-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC 和oe-NC）、si-PRMT1+oe-NC 組（轉(zhuǎn)染si-PRMT1和oe-NC）、si-NC+oe-ZEB1組（轉(zhuǎn)染si-NC和oe-ZEB1）、si-PRMT1+oe-ZEB1組（轉(zhuǎn)染si-PRMT1和oe-ZEB1），根據(jù)分組，按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書所示，將si-NC、oe-NC、si-PRMT1、oe-ZEB1 轉(zhuǎn)染至細胞中。細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，將各組細胞培養(yǎng)基更換為含2%FBS、葡萄糖30 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進行后續(xù)實驗操作。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖

將對數(shù)期生長的HK-2 細胞或者是轉(zhuǎn)染后的HK-2細胞接種于96孔板中，5×103個/孔。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，將HK-2 細胞分為空白對照組和高糖組，將轉(zhuǎn)染后的HK-2細胞分為空白對照組、si-NC+oe-NC組、si-PRMT1+oe-NC組、si-NC+oe-ZEB1組、si-PRMT1+oe-ZEB1組，按照“1.2”項和“1.3”項所述進行細胞處理。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，向細胞中添加CCK-8溶液（10 μL/孔），細胞于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置孵育4 h后，用酶標儀測定每孔在450 nm處的光密度（OD）值。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

收集HK-2 細胞，向細胞中添加預冷PBS 清洗細胞，共清洗2次。重新收集細胞，向細胞中加入1×結(jié)合緩沖液重懸細胞沉淀，并將細胞密度調(diào)整為1×106個/mL。取上述細胞懸液100 μL，向細胞中添加5 μL FITC-Annexin V 和5 μL PI 工作液，充分混勻后，將細胞置于室溫條件下避光孵育15 min。向細胞中加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，充分混勻后，立即用流式細胞儀檢測。

1.6 qRT-PCR 檢測細胞PRMT1 和ZEB1 mRNA 表達

收集HK-2細胞，Trizol法提取細胞RNA。微量分光光度計測定RNA 的純度及濃度，隨后將RNA逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。按照2× SYBR Green qPCR Master Mix 說明書所示，進行qRT-PCR 實驗。反應程序：95 ℃、1 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40 個循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。實驗中所需引物序列，見表1。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算PRMT1和ZEB1 mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR實驗所需引物序列

1.7 Western blotting 檢測細胞PRMT1、ZEB1、Ecadherin、Fibronectin和α-SMA蛋白表達

收集HK-2 細胞，加入含有苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，冰上裂解細胞沉淀。離心收集裂解上清液并對其進行濃度的測定。根據(jù)所測濃度，取30 μg蛋白加至凝膠上樣孔內(nèi)，進行SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳結(jié)束后，進行轉(zhuǎn)膜操作。5%脫脂奶粉室溫孵育2 h，去除非特異性結(jié)合位點。分別加入PRMT1（1∶2 000）、ZEB1（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Fibronectin（1∶2 000）、α-SMA（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗體稀釋液，置于4 ℃條件下，搖床孵育過夜。加入特異性二抗（1∶5 000）抗體稀釋液，室溫條件下?lián)u床孵育1 h。均勻涂抹ECL 發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，Image J 軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.8 CHIP-PCR 和CHIP-qPCR 實驗檢測PRMT1 對ZEB1啟動子的調(diào)控作用

棄去HK-2細胞培養(yǎng)基，加入1%甲醛于37 ℃條件下孵育10 min，冰上終止固定，預冷PBS 清洗細胞。將細胞收集于離心管內(nèi)。加入SDS 裂解緩沖液重懸細胞沉淀，冰上反應10 min，超聲剪切染色質(zhì)DNA，獲得200～1 000 bp 的染色質(zhì)片段。超聲破碎后的產(chǎn)物用5 mol/L的NaCl解交聯(lián)。離心收集上清液，根據(jù)SimpleChIP? Plus Sonication Chromatin IP 試劑盒說明書進行后續(xù)實驗操作。向上清液中添加CHIP 緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物，再加入蛋白A瓊脂糖珠，4 ℃條件下?lián)u床孵育1 h。離心收集上清液，將上清液平均分為3 組：Input 組、IgG 組和PRMT1 組，根據(jù)分組，分別加入Histone H3、IgG和PRMT1 抗體，在4 ℃搖床輕柔搖動過夜。加入蛋白A瓊脂糖珠4 ℃搖床孵育1 h，以形成抗體—蛋白A 免疫復合物。離心收集沉淀，用低、高鹽洗滌液、LiCl 洗滌液、TE Buffer 依次洗滌沉淀。加入200 μL洗脫緩沖液洗滌沉淀，離心收集上清。加入20 μL 5 mol/L 的NaCl 解交聯(lián)。隨后加入10 μL 0.5 mol/L EDTA、20 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH=6.5）、2 μL 10 mg/mL 蛋白酶K，45 ℃條件下孵育10 min。按照膠回收試劑盒說明書回收DNA 片段。以回收的DNA 為模板，用PCR 擴增法檢測ZEB1 啟動子DNA，PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。另外，以回收DNA 為模板進行qPCR 實驗。ZEB1 上游引物：5’-CCAAAATGGAGGGCTCAACA-3’；ZEB1下游引物：5’-AATGTGGCTGATTATTTGGC-3’。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均值±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖對HK-2細胞增殖、凋亡和EMT的影響

與空白對照組相比，高糖組細胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），Ecadherin蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05），而Fibronectin 和α-SMA 蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 高糖對HK-2細胞增殖、凋亡和EMT的影響

2.2 高糖對HK-2細胞中PRMT1和ZEB1表達的影響

與空白對照組相比，高糖組細胞中PRMT1 和ZEB1 mRNA 相對表達水平明顯升高（P＜0.05），PRMT1 和ZEB1 蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 高糖對HK-2細胞中PRMT1和ZEB1表達的影響

2.3 PRMT1 通過與ZEB1 啟動子區(qū)域結(jié)合調(diào)控ZEB1的表達

與空白對照組相比，si-NC 組細胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與si-NC 組相比，si-PRMT1 組細胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）（圖3A）。Consite（http://consite.genereg.net/）和JASPAR（http://jaspar.binf.ku.dk/）軟件分析ZEB1 啟動子區(qū)域潛在的PRMT1結(jié)合位點，CHIP-PCR 實驗檢測PRMT1 對ZEB1 啟動子的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，PRMT1組和Input組含有ZEB1 被擴增區(qū)段DNA，而陰性對照IgG 組沒有（圖3B）。與IgG組相比，PRMT1組ZEB1啟動子區(qū)域（-327至-179 bp）明顯富集（P＜0.05）（圖3C）。

圖3 PRMT1通過與ZEB1啟動子區(qū)域結(jié)合調(diào)控ZEB1的表達

2.4 si-PRMT1 和oe-ZEB1 對HK-2 細胞中PRMT1和ZEB1表達的影響

與空白對照組相比，si-NC+oe-NC 組細胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與si-NC+oe-NC組相比，si-PRMT1+oe-NC組細胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表達明顯降低（均P＜0.05），si-NC+oe-ZEB1 組細胞中PRMT1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），ZEB1 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與si-PRMT1+oe-NC 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞中PRMT1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），ZEB1 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與si-NC+oe-ZEB1 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞中PRMT1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），ZEB1蛋白表達明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 si-PRMT1和oe-ZEB1對HK-2細胞中PRMT1和ZEB1表達的影響

2.5 PRMT1/ZEB1 軸對HK-2 細胞增殖和凋亡的影響

高糖處理各組細胞，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，si-NC+oe-NC組細胞增殖能力和細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與si-NC+oe-NC組相比，si-PRMT1+oe-NC 組細胞增殖能力明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），si-NC+oe-ZEB1組細胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與si-PRMT1+oe-NC 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與si-NC+oe-ZEB1組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1組細胞增殖能力明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 PRMT1/ZEB1軸對HK-2細胞增殖和凋亡的影響

2.6 PRMT1/ZEB1軸對HK-2細胞EMT的影響

高糖處理各組細胞，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，si-NC+oe-NC 組細胞中E-cadherin、Fibronectin 和α-SMA 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；與si-NC+oe-NC組相比，si-PRMT1+oe-NC組細胞E-cadherin 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)ibronectin 和α-SMA 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），si-NC+oe-ZEB1 組細胞E-cadherin 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)ibronectin和α-SMA蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與si-PRMT1+oe-NC 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞E-cadherin 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)ibronectin和α-SMA蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與si-NC+oe-ZEB1 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞E-cadherin 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)ibronectin和α-SMA蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 PRMT1/ZEB1軸對HK-2細胞EMT的影響

3 討論

糖尿病腎病已經(jīng)成為人類一個主要的公共衛(wèi)生問題，給個人、家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔[8]。腎小管上皮細胞EMT被認為是糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化形成的關(guān)鍵過程。盡管已有多種信號通路或介質(zhì)在體外或體內(nèi)調(diào)控腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化或纖維化形成，但糖尿病誘導腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化的詳細分子機制尚不完全清楚[9]。鑒于EMT在糖尿病腎病腎組織損傷發(fā)展過程中的致病作用，闡明導致糖尿病腎病腎纖維化的相關(guān)分子機制對于確定治療靶點是至關(guān)重要的。

EMT在纖維化的發(fā)展過程中起著重要作用，上皮細胞處于特定的生理或病理情況下，可激活一系列信號轉(zhuǎn)導途徑，抑制上皮細胞上皮相關(guān)蛋白(Ecadherin)表達，促使間充質(zhì)標志物(Fibronectin 和α-SMA)表達增加，最終獲得具有侵襲能力的間充質(zhì)表型，從而產(chǎn)生更多的成纖維細胞樣細胞[10]。PRMTs家 族由Ⅰ型PRMTs(PRMT1、PRMT 2、PRMT 3、PRMT 4、PRMT 6 和PRMT 8) 和Ⅱ型PRMTs(PRMT5和PRMT9)組成。其中PRMT1已被證實參與調(diào)控乳腺癌細胞EMT 過程。此外，PRMT1 可促進心外膜侵襲和EMT過程，是調(diào)節(jié)心室形態(tài)發(fā)生和冠狀動脈形成的重要因子[11]。PRMT1 還可促進糖尿病高血糖，在生理和病理條件下可調(diào)節(jié)糖異生和介導葡萄糖穩(wěn)態(tài)，肝臟特異性PRMT1 缺乏可明顯改善糖尿病高血糖[12]。已有研究表明，棕櫚酸鹽可上調(diào)PRMT1 表達，敲低PRMT1 可明顯抑制棕櫚酸鹽誘導的腎小球系膜細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[13]。Chen等[14]的研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病患者血清中PRMT1的水平和糖尿病腎病小鼠腎組織中PRMT1的表達明顯升高。高糖可誘導體外培養(yǎng)的腎小管細胞中PRMT1表達增加。敲低PRMT1可抑制高糖誘導的腎小管細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞凋亡和EMT。腎臟細胞在高糖等損傷性刺激后的表型轉(zhuǎn)化在糖尿病腎病的進展中起著至關(guān)重要的作用[15]，本研究用含葡萄糖30 mmol/L 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細胞，結(jié)果顯示，高糖可抑制HK-2 細胞增殖，誘導細胞凋亡，促進細胞EMT。此外，高糖還可促進HK-2 細胞中PRMT1 的表達，而敲低PRMT1 后，可促進HK-2 細胞增殖，抑制細胞凋亡和EMT。該研究結(jié)果與Chen等[14]的研究結(jié)果一致，表明高糖誘導的PRMT1表達可促進糖尿病腎病疾病進展。

PRMT1 是催化蛋白質(zhì)精氨酸甲基化過程的關(guān)鍵酶，其甲基化底物蛋白包括組蛋白H4 和非組蛋白FOXO1、ERα、MRE11 和53BP1 等[16]。PRMT1 甲基化組蛋白H4R3 發(fā)生非對稱性二甲基化（H4R3me2as），進而激活ZEB1 的表達。ZEB1 位于人類染色體10p11.22 上，是PRMT1 所介導的EMT及其相關(guān)功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。ZEB1 可以通過EMT 促進細胞增殖、遷移和膠原形成，最終誘導纖維化[17]。已有研究表明，ZEB1參與肝纖維化疾病進展，果糖通過上調(diào)ZEB1表達促進EMT，從而誘導肝纖維化[18]。ZEB1 介導的人肺泡上皮Ⅱ型細胞中的EMT通過旁分泌信號傳遞給潛在的成纖維細胞，促進了肺纖維化的發(fā)展。靶向ZEB1可能是治療肺纖維化的一個可行的策略[19]。Tang等[20]的研究結(jié)果顯示，高糖刺激可誘導HK-2 細胞中ZEB1 的表達，促進細胞EMT。敲低ZEB1 表達可逆轉(zhuǎn)高糖誘導的EMT。此外，目前已有證據(jù)顯示，在胰腺癌中，PRMT1通過與ZEB1啟動子區(qū)域結(jié)合上調(diào)ZEB1的表達，從而促進胰腺癌細胞增殖和侵襲[21]。本研究結(jié)果顯示，高糖刺激可誘導HK-2細胞中ZEB1的表達，進一步抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和EMT。敲低PRMT1 后，HK-2 細胞中ZEB1 的表達下調(diào)，而過表達ZEB1對HK-2細胞中PRMT1表達無明顯影響。進一步實驗結(jié)果表明，過表達ZEB1 可逆轉(zhuǎn)敲低PRMT1對高糖誘導的HK-2細胞的影響，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和EMT。敲低PRMT1 則可逆轉(zhuǎn)過表達ZEB1對高糖誘導的HK-2細胞的影響，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡和EMT。表明高糖誘導的PRMT1 通過上調(diào)ZEB1 表達促進糖尿病腎病疾病進展。

綜上所述，高糖刺激可抑制HK-2細胞增殖，促進細胞凋亡和EMT，上調(diào)PRMT1 和ZEB1 表達。PRMT1通過與ZEB1啟動子區(qū)域結(jié)合上調(diào)ZEB1的表達，從而抑制高糖刺激的HK-2細胞增殖，促進細胞凋亡和EMT。本研究結(jié)果為明確糖尿病腎病腎纖維化的相關(guān)分子機制及開發(fā)新的治療靶點提供了新的依據(jù)。