楊 璇，劉天民，陳婷婷，劉 青，吳舒懋，左立旻△

（1.四川電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院 成都市婦女兒童中心醫(yī)院急診科，成都 611731；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院病理科，成都 610041；3.四川電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院 成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童心血管科，成都 611731）

急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是兒童和青少年發(fā)病率較高的惡性腫瘤，以白血病細(xì)胞在骨髓大量聚集，骨髓正常造血功能受到抑制為特征[1]。雖然化療在一定程度上提高了ALL 患兒的長(zhǎng)期無(wú)病生存率，但依然有部分患者對(duì)化療敏感性低，或者緩解后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，預(yù)后不甚理想[2]。因此，全面了解ALL進(jìn)展的潛在機(jī)制，尋找抑制ALL 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其的凋亡方法有助于開(kāi)發(fā)有效的ALL 防治策略。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類(lèi)具有典型封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，其長(zhǎng)度介于100 到數(shù)千個(gè)核苷酸之間，其可與微小RNA（miRNA）結(jié)合，在功能上抑制miRNA 從而恢復(fù)miRNA 靶基因mRNA 表達(dá)，參與細(xì)胞多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，與包括ALL在內(nèi)的人類(lèi)疾病進(jìn)展息息相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA 0030018（circ_0030018）在食管癌中表達(dá)增加，沉默circ_0030018通過(guò)上調(diào)miR-599 可抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程[4]。但circ_0030018 在A(yíng)LL 中的表達(dá)和功能目前尚不清楚。把基因預(yù)測(cè)到miR-1298 是circ_0030018 的潛在靶點(diǎn)。研究報(bào)道m(xù)iR-1298 低表達(dá)與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，并預(yù)示胃癌患者無(wú)病生存期和總生存期較差[5]。miR-1298下調(diào)還可預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后，過(guò)表達(dá)miR-1298對(duì)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生具有抑制作用[6]?；谏鲜鲆延醒芯?，本研究分析了ALL 患者骨髓組織中circ_0030018 和miR-1298 表達(dá)水平，研究circ_0030018 對(duì)ALL 細(xì)胞KOCL44增殖、凋亡的影響，并以miR-1298為切入點(diǎn)探討其分子機(jī)制，旨在為臨床治療ALL 提供有效靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源

本研究所有組織樣本來(lái)源于2017 年7 月至2019年12月在本院血液腫瘤科就診的23例ALL患兒的骨髓組織。23 例ALL 患兒均為初診ALL 患兒，男13 例，女10 例，年齡2.3～14.5 歲，中位年齡10.0歲。同時(shí)期招募23健康志愿者作為對(duì)照組，其中男13 例，女10 例，中位年齡10.5 歲。對(duì)照組和ALL 組比較年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有受試者監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞和試劑

人ALL 細(xì)胞KOCL44 購(gòu)于美國(guó)限定培養(yǎng)物保藏中心；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；Prime-Script 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本Takara 公司；通用型SYBR qPCR Master Mix 購(gòu)于南京諾唯贊生物科技公司；小干擾RNA（si-RNA）、miRNA 模擬物（mimics）、miRNA抑制物（anti-miRNA）、重組熒光素酶質(zhì)粒購(gòu)于上海生工生物公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購(gòu)于福州飛凈生物科技公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博生物公司；兔抗人裂解的半胱氨酸蛋白酶3（cleavedcaspase-3）多克隆抗體、兔抗人cleaved-caspase-9 單克隆抗體、兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)circ_0030018 和miR-1298 表達(dá) ALL 組于治療前采集骨髓4 mL，對(duì)照組于入院時(shí)采集骨髓4 mL，加入EDTA抗凝保存?zhèn)溆?。用TRIzol 試劑從ALL 患者和健康志愿者骨髓組織中提取總RNA，然后使用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR 分析采用通用型SYBR qPCR Master Mix 進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為circ_0030018的內(nèi)參，以U6為miR-1298的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt公式分析circ_0030018和miR-1298相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 KOCL44 細(xì)胞接種到12%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，在37 ℃、飽和濕度、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取2×105個(gè)對(duì)數(shù)期KOCL44細(xì)胞接種到6孔板，參照Lipofectamine 2000 說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染si-RNA、miRNAs，最終濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。實(shí)驗(yàn)分組如下：si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-circ_0030018 組（轉(zhuǎn)染si-circ_0030018）、miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-1298 組（轉(zhuǎn)染miR-1298 mimics）、si-circ_0030018+anti-miR-NC 組（轉(zhuǎn)染sicirc_0030018與anti-miR-NC）、si-circ_0030018+antimiR-1298 組（轉(zhuǎn) 染si-circ_0030018 與anti-miR-1298）。

1.3.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆能力 按照5×102個(gè)/孔的密度接種細(xì)胞到6孔板，米字型轉(zhuǎn)動(dòng)平板均勻分散細(xì)胞。放入培養(yǎng)箱孵育10～14 d，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞集落時(shí)終止培養(yǎng)。分別用4%多聚甲醛、0.1%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞集落進(jìn)行固定和染色。用流水緩慢沖去染色液，空氣干燥。在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落形成數(shù)。

1.3.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 取5×103個(gè)KOCL44細(xì)胞接種96孔板上，常規(guī)培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，細(xì)胞再孵育2 h，細(xì)胞活力以酶標(biāo)儀測(cè)得的450 nm處的光密度（OD）值表示。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 PBS漂洗KOCL44 細(xì)胞兩次，加入1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。取100 μL 細(xì)胞懸液加入到流式管內(nèi)，加入5 μL 的Annexin V-FITC 和PI，暗室染色15 min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6 蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)cleaved-caspase 3和cleavedcaspase 9 蛋白表達(dá) 向KOCL44 細(xì)胞中加入RIPA緩沖液，于冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。按照4∶1 比例將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混勻，沸水浴3 min 變性蛋白。蛋白（30 μg/泳道）用10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜。將膜在5%脫脂牛奶中在室溫下封閉1 h。TBST洗滌后，用以下一抗4 ℃孵育過(guò)夜：抗cleaved-caspase-3 抗體（1 μg/mL）、cleaved-caspase-9 抗體（1:500）、內(nèi)參GAPDH 抗體（1:2 500）。TBST 洗滌后，用1:2 000 的IgG 二抗室溫孵育1 h。用吸水紙吸去膜上過(guò)多液體，放在保鮮膜上，滴加化學(xué)發(fā)光試劑孵育2 min。采用化學(xué)發(fā)光成像儀分析目的蛋白表達(dá)量。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將含有miR-1298 假定結(jié)合位點(diǎn)的circ_0030018 野生型（WT）序列或突變型（MUT）序列克隆到pGL3 載體中，命名為WTcirc_0030018 或MUT-circ_0030018。使 用Lipofectamine 2000 將miR-1298 mimics、miR-NC 與WTcirc_0030018或MUT-circ_0030018共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0030018 和miR-1298 在A(yíng)LL 組和對(duì)照組單核細(xì)胞中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，ALL組骨髓組織中circ_0030018表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），miR-1298 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 干擾circ_0030018 表達(dá)對(duì)ALL 細(xì)胞KOCL44增殖和凋亡的影響

與si-NC組比較，si-circ_0030018組KOCL44細(xì)胞circ_0030018 表達(dá)量、細(xì)胞OD 值、克隆形成數(shù)顯著下降（P＜0.05），凋亡率、cleaved-caspase 3 和cleaved-caspase 9 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 干擾circ_0030018表達(dá)對(duì)ALL細(xì)胞KOCL44增殖和凋亡的影響

2.3 miR-1298 過(guò)表達(dá)對(duì)ALL 細(xì)胞KOCL44 增殖和凋亡的影響

與miR-NC 組比較，miR-1298 組KOCL44 細(xì)胞miR-1298表達(dá)量、凋亡率、cleaved-caspase 3 和cleaved-caspase 9 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)顯著下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 miR-1298過(guò)表達(dá)對(duì)ALL細(xì)胞KOCL44增殖和凋亡的影響

2.4 circ_0030018靶向調(diào)控miR-1298的表達(dá)

Circular RNA Interactome 預(yù)測(cè)到circ_0030018與miR-1298 序列間存在互補(bǔ)位點(diǎn)，見(jiàn)圖4A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，同與WT-circ_0030018 共轉(zhuǎn)染，miR-1298組KOCL44細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性顯著低于miR-NC 組（P＜0.05）；同與MUT-circ_0030018 共轉(zhuǎn)染，miR-1298 組KOCL44 細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與miR-NC 組比較無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖4B。pcDNA-circ_0030018 組KOCL44細(xì)胞miR-1298 表達(dá)量顯著低于pcDNA 組（P＜0.05）；si-circ_0030018 組KOCL44 細(xì)胞miR-1298 表達(dá)量顯著高于si-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖4C。

圖4 circ_0030018靶向調(diào)控miR-1298的表達(dá)

2.5 抑制miR-1298 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0030018表達(dá)對(duì)ALL細(xì)胞KOCL44增殖和凋亡的作用

與si-circ_0030018+anti-miR-NC組比較，sicirc_0030018+anti-miR-1298 組KOCL44 細(xì)胞miR-1298 表達(dá)量、凋亡率、cleaved-caspase 3 和cleavedcaspase 9 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 抑制miR-1298表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0030018表達(dá)對(duì)ALL細(xì)胞KOCL44增殖和凋亡的作用

3 討論

與長(zhǎng)鏈非編碼RNA不同，circRNA主要由前體RNA反向剪切形成，具有高度穩(wěn)定性和組織分布特異性，在人類(lèi)癌中可能作為潛在的預(yù)后、診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)分析circ_0012152和circ_0001857表達(dá)能夠準(zhǔn)確區(qū)分ALL和急性髓系白血病[7]。ALL 細(xì)胞中circ_0000745 上調(diào)可通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路增加ALL 細(xì)胞活力、降低細(xì)胞凋亡率[8]。circRNA漿細(xì)胞瘤多樣異位基因1（circPVT1）在A(yíng)LL 骨髓樣本中高表達(dá)，沉默circPVT1通過(guò)抑制其原癌基因c-Myc和抗凋亡蛋白B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。本研究探討了circ_0030018 在A(yíng)LL 進(jìn)展中的作用，結(jié)果表明ALL 患者骨髓組織中circ_0030018表達(dá)顯著上調(diào)，提示circ_0030018表達(dá)增加可能促進(jìn)ALL 進(jìn)展。進(jìn)行功能缺失實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circ_0030018 功能，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染si-circ_0030018 干擾circ_0030018 表達(dá)顯著降低KOCL44 細(xì)胞活力和克隆形成能力，增加細(xì)胞凋亡。與本研究中干擾circ_0030018 的抗癌作用一致，Song 等[10]指出膠質(zhì)瘤組織、細(xì)胞中circ_0030018 表達(dá)增加，干擾circ_0030018阻礙了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，加速了細(xì)胞凋亡。當(dāng)受到凋亡刺激時(shí)線(xiàn)粒體釋放的細(xì)胞色素C 會(huì)介導(dǎo)caspase 9 激活，活化的caspase 9進(jìn)一步加工其他caspase成員，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此cleaved-caspase 9 和cleavedcaspase 3 常被用作細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)記物[11-12]。本研究中干擾circ_0030018顯著增加cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3 蛋白表達(dá)水平，這與干擾circ_0030018的促凋亡作用吻合。

miR-1298在多種惡性腫瘤中廣泛下調(diào)，具有抑癌因子作用。研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中miR-1298-5p低表達(dá)，與膠質(zhì)瘤患者的高組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)，可預(yù)測(cè)預(yù)后不良[13]。miR-1298 的下調(diào)與乳腺癌患者晚期進(jìn)展顯著相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-1298可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期停滯[14-15]。miR-1298 通過(guò)下調(diào)黏著斑激酶（FAK）和層粘連蛋白亞基β3（LAMB3）抑制突變型鼠類(lèi)肉瘤病毒癌基因（KRAS）驅(qū)動(dòng)的腫瘤生長(zhǎng)[16]。膀胱癌中miR-1298亦呈低表達(dá)，miR-1298通過(guò)靶向下調(diào)連接蛋白3（Cx43）表達(dá)明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的惡性表型[17]。與上述發(fā)現(xiàn)類(lèi)似，本研究證實(shí)miR-1298 在A(yíng)LL 患者骨髓組織中表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-1298 mimics 過(guò)表達(dá)miR-1298降低了KOCL44細(xì)胞的活力和克隆形成能力，增加cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明miR-1298 在膀胱癌中具有腫瘤抑制功能。進(jìn)一步研究顯示，miR-1298是circ_0030018 的直接下游靶點(diǎn)，且miR-1298 受到circ_0030018的負(fù)性調(diào)控。由于過(guò)表達(dá)miR-1298與干擾circ_0030018 在A(yíng)LL 中抗癌作用一致，本研究推測(cè)KOCL44細(xì)胞中可能存在circ_0030018/miR-1298調(diào)控途徑。深入分析發(fā)現(xiàn)，抑制miR-1298表達(dá)能夠明顯削弱干擾circ_0030018對(duì)KOCL44細(xì)胞增殖的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，這表明干擾circ_0030018通過(guò)靶向上調(diào)miR-1298 表達(dá)抑制ALL 進(jìn)展。然而，本研究仍存在一些不足，是否存在其他miRNA參與circ_0030018調(diào)控ALL進(jìn)展，miR-1298的下游靶點(diǎn)仍需要進(jìn)一步研究。

綜上，干擾circ_0030018 可抑制ALL 細(xì)胞KOCL44增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與靶向上調(diào)miR-1298表達(dá)有關(guān)，這表明circ_0030018/miR-1298有望成為臨床治療ALL的新型靶點(diǎn)。